Bir Türk populasyonunda sitokrom P-450 2C9 (CYP2C9) mutasyon sıklığının ve fenitoin kullanılarak genotip/fenotip korelasyonunun incelenmesi

Abstract

ÖZET Yüksek Lisans Tezi BİR TÜRK POPULASYONUNDA SİTOKROM P450 2C9 (CYP2C9) MUTASYON SIKLIĞININ VE FENİTOİN KULLANILARAK GENOTİP / FENOTlP KORELASYONUN İNCELENMESİ Ecz. Pınar GÜZELBEY Gaziantep Üniversitesi- Sağlık Bilimleri Enstitüsü Farmakoloji Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. A. Şükrü AYNACIOĞLU Nisan 2000 Sitokrom P-450 2C9 (CYP2C9) enzimi, polimorfik olduğu saptanan enzimlerden biridir. Fenitoin, S-varfarin, tolbutamid, fluoksetin, amitriptilin ve meloksikam da dahil birçok nonsteroidal antiinflamatuvar ilacın (NSAİ) metabolizmasından sorumlu bu enzimin aktivitesi bireyler arası ve toplumlar arası önemli farklılıklar göstermektedir. CYP2C9 aktivitesini etkilediği belirlenen iki önemli mutasyon, sistein144 (CYP2C9*2) ve Iözin359 (CYP2C9*3) aminoasit varyantlarıdır. Türk toplumunda CYP2C9 polimorfizmi daha önce araştırılmamış olduğundan bu çalışmada Türk bireylerindeki CYP2C9*2 ve CYP2C9*3 mutasyon sıklıkları saptanmaya çalışılmıştır. Ayrıca fenitoin kullanarak fenotip ve genotip arasında bir korelasyon bulunup bulunmadığının araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmamızda 101 Türk bireyinden (30 kadın, 71 erkek ) izole edilen DNA örneklerinde söz konusu iki mutasyonun sıklığı polimeraz zincir reaksiyonu (polymerase Chain reaction: PCR) ve restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi (restriction fragment length polymorphism: RFLP) yöntemleri ile araştırıldı. Aynı gruptaki deneklere bir defada, oral yoldan 300 mg fenitoin verilerek fenotiplemeyapıldı. Fenotipleme için fenitoin uygulamasından 12 saat sonra kan örnekleri toplandı. Ayrılan serumda fenitoin ve metaboliti 5-(4 p-hidroksifenil)-5-fenilhidantoin (p-HPPH)'in konsantrasyon analizlerinde yüksek performanslı likit kromotografisi (High Performance Liquid Cromotography: HPLC) yönteminden yararlanıldı. p-HPPH/fenitoin oranının CYP2C9 mutasyonları ile fonksiyonel ilişkisi değerlendirildi. Çalışma sonucunda CYP2C9 genotip sıklıkları CYP2C9*1/1, CYP2C9*1/2, CYP2C9*2/2, CYP2C9*1/3 için sırasıyla %67, %13, %3 ve %16 olarak bulundu. Aktiviteyi en fazla etkileyen CYP2C9*3/3 için ise bu sıklığın yaklaşık %1 olduğu belirlendi. Ortalama fenitoin düzeyleri (mg/L`1) CYP2C9*1/1 genotipinde 4.16, CYP2C9*1/2 genotipinde 5.52 ve CYP2C9*1/3 genotipinde 5.65 olarak saptandı. p-HPPH/fenitoin oranları ise CYP2C9*1/1, CYP2C9*1/2, CYP2C9*2/2, CYP2C9*1/3 ve CYP2C9*3/3 için sırasıyla 0.43, 0.26, 0.14, 0.21 ve 0.02 olarak bulundu. Bulgularımızdan CYP2C9 mutasyonlarının görülme sıklıklarının diğer bazı Avrupa toplumları için bildirilen değerlerden farklı olmadığı saptandı. Bunun yihlı sıra fenitoin serum düzeylerindeki bireyler arası değişkenliğin yaklaşık %30'unun genotiplerle açıklanabileceği, 12 saat sonraki serum fenitoin düzeyinin rutin fenotiplemede kullanılabileceği ve p-HPPH/fenitoin oranının CYP2C9 aktivitesinin in vivo göstergelerinden biri olabileceği sonuçlarına varıldı. Anahtar Kelimeler: Sitokrom P450 2C9 (CYP2C9), polimorfizm, fenitoin, farmakogenetik, Türk populasyonu. &

ABSTRACT M.S. Thesis THE INVESTIGATION OF THE FREQUENCY OF CYTOCHROME P4502C9 {CYP2C9) AND THE CORRELATION BETWEEN GENOTYPE/PHENOTYPE USING PHENYTOIN Ecz. Pınar GÜZELBEY Gaziantep University-Institute of Health Sciences Department of Pharmacology Supervisor: Associate Professor A. Şükrü AYNACIO?LU APRIL-2000 Cytochrome P450 (CYP2C9) is one of the enzymes identified to be polymorphic. The activation of this enzyme, which is responsible for the metabolism of phenytoin, S-warfarin, tolbutamide, fluoxetine, amitriptyline and several nonsteroidal antirheumatics including meloxicam differs interindividually and interethnically. Two important mutations which were determined to influence the activation of CYP2C9 are cysteine`! 44 (CYC2C9*2) and Ieucine359 (CYC2C9*3) amino acid variants. The aim of this study was to investigate both the mutation frequencies of CYP2C9*2 and CYP2C9*3 in Turkish individuals due to the fact that CYP2C9 polymorphism has not yet been investigated and whether there is correlation between phenotype and genotype by using phenytoin. Hundred and one Turkish individuals (30 female, 71 male) were included into the study. DNA was extracted from EDTA blood samples from each individual. The two mutation frequencies mentioned above were investigated using polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragment length polymorphism (RFLP). The subjects in the same group were given one dose of 300 mg phenytoin orally for phenotyping and blood samples were taken 12 hours later. The concentration of mphenytoin and it's metabolite 5-(4 para-hydroxyphenyl)-5-phenylhydantoin (p-HPPH) in the serum extracted from blood samples were analyzed by using high performance liquid cromotography (HPLC). The results of the study revealed that the distribution frequency of CYP2C9*1/*1, CYP2C9*1/*2, CYP2C9*2/2 and CYP2C9*1/*3 genotypes were 67%, 13%, 3% and 16% respectively. The frequency of CYP2C9*3/*3, the most influencing factor on CYP2C9 activity, was found to be -1%. The average phenytoin levels were determined to be 4.16 mg/L`1 for genotype CYP2C9*1/*1, 5.52 for CYP2C9*1/*2 and 5.65 for CYP2C9*1/*3. p-HPPH/phenytoin ratios for CYP2C9*1/*1, CYP2C9*1/*2, CYP2C9*2/*2, CYP2C9*1/*3 and CYP2C9*3/*3 were found to be 0.43, 0.26, 0.14, 0.21 and 0.02 respectively. On the basis of the data, it concluded that the mutation frequency of CYP2C9 does not differ from that of some European communities. It was also concluded that approximately 30% of the inter individual variations in the phenytoin level in the serum could be explained by means of genotypes, that the phenytoin level 12 hours after the application could be used in the routine phenotyping and that p-HPPH/phenytoin metabolic ratio could be one of the in vivo values. Key words: Cyctochrome P4502C9 (CYP2C9), polymorphism, phenytoin, pharmacogenetics, Turkish population. [V