İnsan immünoglobülin G`sine karşı monoklonal antikor elde edilmesi

Abstract

İNSAN IMMUNOGLOBULIN G'SİNE KARŞI MONOKLONAL ANTİKOR ELDE EDİLMESİ ÖZET 1975 yılında Georges J.F. Köhler ve Cesar Müstein tarafindan geliştirilen hibridoma teknolojisi ile hücre soylarının oluşturulması, antikorların sentezlenmesini de mümkün kılmıştır. Tek bir çeşit antikor sentezleyen fakat yaşam süreleri sınırlı olan B lenfositleri ile ölümsüz miyelom hücrelerinin birleştirilmesi bu teknoloji sayesinde gerçekleşmiştir. Gerçekleşen bu füzyonun ardından hücreler seçici besi yerine alınmış, sadece iki özelliği birden taşıyan hücrelerin, hibridomalann, bu ortamda yaşamaları mümkün olmuştur. Sonuç olarak ölümsüzlük özelliğine sahip, aynı antikordan sınırsız miktarda üreten B lenfositleri üretilmiştir. Hücre kültürlerinde gelişen bu hücreler sadece tek bir antijenik yapıyı tanıdıklarından seçicilikleri yüksektir. Bu özelliklerinden dolayı monoklonal antikorların kullanım alanları çok geniştir. Bu antikorlar tedavi, tam ve araştırma amaçlı olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmada BALB-c fareleri çeşitli zaman aralıklarında insan İgG'si ile aşılanmış, yeterli antikor seviyesine ulaşıldığında fare dalağı çıkarılarak parçalanmış, miyelom hücreleri ile birleştirilmiş ve hibrit hücreler HAT içeren besi yerinde seçilerek çoğaltılmıştır. Hibridomalann ürettiği antikor miktarı ELISA yöntemiyle saptanmıştır. Yüksek pozitiflik veren klonlar alt klonlama işlemine tabi tutulduktan sonra bu hücreler arasından ELISA kontrollerinde uygun nitelikte antikor salgıladığı belirlenen klonlar serum içermeyen ortamda çoğaltılmış ve hücre üst sıvıları toplanmıştır. Hücre üst sıvılarının içerdiği antikor Protein G kolondan geçirilerek saflaştınlmış ve elde edilen preparatın saflığı poliakrilamid jel elektroforezi ile kontrol edilmiştir. Primer antikor olarak hücre üst sıvılarının kullanıldığı Western blot analizleri ile, elde edilen antikorların insan İgG, İgA ve İgM izoformlan ile verdikleri reaksiyonlar değerlendirilmiştir. Sonuç olarak insan İgG'sine karşı monoklonal antikor üreten 13 klon elde edilmiştir. Bu klonlann ürettikleri antikorların İgM ve İgA ile de reaksiyon verdikleri saptanmıştır. Anahtar kelimeler: Hibridoma, Hücre jüzyonu, Monoklonal antikor, İgG

DEVELOPMENT OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO HUMAN IMMUNOGLOBULIN G ABSTRACT The production of monoclonal antibodies has been possible after the development of hybridoma technology at 1975. This technology was based on the fusion of B lymphocytes and myeloma cells, the result of which is generation of antibody producing immortal hybridoma cells. After the fusion, it is necessary to select hybridoma cells over myeloma cells. This is accomplished by a selection medium containing Hypoxantlnne-Aminopterin-Thymidme (HAT) which kills myeloma cells. After this selection hybridoma cells are cloned to produce monoclonal cell lines which produce highly selective monoclonal antibodies against the antigen. This selectivity makes them suitable for wide application areas. These monoclonal antibodies are used for treatment, diagnosis and research aims. In this study, BALB-c mice were immunized with human IgG by weekly injections. B lymphocytes were isolated from the spleen of the immunised mice when adequate antibody levels were reached. B lymphocytes and myeloma cells were fused and hybrid cells were selected in the HAT-containing medium. The clones which give high positive results were sub-cloned which then were screened with ELISA for high and selective antibody production. The cells were then transferred into a serum free medium and cell supernatants were collected. Purification of supernatants was performed by passing through Protein G column and purity of antibodies was confirmed by polyacrylamide gel electrophoresis. Cell supernatants were used as primary antibodies in Western Blot and tested for their reaction with human IgG, IgM, IgA. Resultingly, 13 clones producing monoclonal antibodies against human IgG were obtained. These antibodies were found to react also with human IgM, IgA. Key words: Cell fusion, Hibridoma, Monoclonal antibodies, IgG 11