Bacillus pumilus Y7 katalaz (katX2) geninin klonlanması

Abstract

Bacillus pumilus, mezofilik bir bakteri olup penisilin oksidaz ve/veya peroksidaz gibi ikincil bir aktiviteye sahip hücre içi katalaz enzimi üretmektedir. Bu çalışmada, enzime ait ikincil peroksidaz/oksidaz özelliğinin ayrıntılı olarak irdelenebilmesi için ileride gerçekleştirilmesi planlanan yönlendirilmiş mutasyon çalışmalarında kullanılmak üzere B. pumilus katalazını kodlayan katX2 geninin klonlanması ve Escherichia coli'de üretimi amaçlanmıştır. Restriksiyon enzimlerinden bağımsız gerçekleştirilen klonlama tekniğinde ilk olarak katX2 geni kimerik primerler (5'katX2; 3'katX2) ile bir araya getirilerek megaprimer oluşturulmuş ve sonrasında bu megaprimer ekspresyon vektörüne başarılı bir şekilde aktarılmıştır. Klonlama sırasında genomik DNA konsantrasyonu, primer bağlanma sıcaklık aralığı, polimeraz enzim tipi, vektör:megaprimer oranı, reaksiyon döngü sayısı ve koşulu başta olmak üzere birçok parametre denenerek optimizasyon çalışmaları yürütülmüştür. 510 amino asitten oluşan olgun proteini kodlayan katX2 genini taşıyan pET28aTEV vektörü E. coli BL21 (DE3 star) hücrelerine transforme edilmiştir. Transformantlarda katalaz aktivitesi için en yüksek değer (80 µmol/ml/dk) 30ºC'de, IPTG (0,1 mM) varlığında, 120 rpm çalkalama hızında 24 saat büyütüldüğü ekspresyon koşullarında ulaşılmıştır.

A mesophilic soil microorganism Bacillus pumilus produces an intracellular catalase with secondary penicillin oxidase/peroxidase activity. The aim of this study was to clone B. pumilus catalase encoding gene (katX2) and express the gene in Escherichia coli for further investigation of its secondary activity via site directed mutagenesis studies. katX2 gene was first amplified as megaprimer which includes chimeric primers (5'katX2 and 3'katX2) by using restriction free cloning technique and then the megaprimer was successfully inserted into expression vector. During cloning, optimization studies were performed by testing several parameters including genomic DNA concentration, primer binding temperature, polymerase enzyme type, vector:megaprimer rate, number of reaction cycles and conditions. The pET28aTEV vector carrying catalase encoding katX2 gene consisting of 510 amino acids was transformed into E. coli BL21 (DE3 star) cells. Catalase activity of the transformants reached at their highest level (80 µmol/ml/min) when cells were expressed at 30°C and 120 rpm for 24 hours in the presence of IPTG (0.1 mM).