Insan b2-adrenerjık reseptöründe oluşturulan bazı mutasyonların reseptör-yeşil floresan protein füzyonu ile hücre içi dağılımının incelenmesi

Abstract

Hücreler arasında nörotransmiterler, hormonlar, otakoidler gibi kimyasal mediyatörler ile iletilen sinyallerin büyük bir bölümü G proteinlerine kenetli reseptörlerle (GPCR) algılanır. Tıpta kullanılan ilaçların %70'inin hedefini oluşturan bu reseptörlerin sinyal iletme mekanizmalarının ayrıntıları güncelliğini koruyan sıcak araştırma alanlarından biridir. Bu çalışmada bu reseptörlerin moleküler aktivasyon mekanizmasının daha iyi anlaşılmasına katkısı olabilecek bir konstitütif aktivatör mutasyon (insan b2-reseptöründe F282L), yaban tip reseptör ve CAM mutantıyla karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Çalışmada, heterolog transfeksiyon için HEK 293 hücreleri ve bu reseptörlerin prototipik bir örneği olan insan b2-adrenoseptörü deneysel model olarak kullanılmıştır. F282L mutantının, ligand bağlama sinyal iletme gibi özelliklerinin yanı sıra hücre içi dağılımı ve trafiğini incelemek üzere yeşil floresan protein ve onun bir variyantı olan dendra proteini ile yaban tip ya da mutant reseptörlerin birleşik (füzyon) proteinleri elde edilmiş ve bu tür çalışmalara teknolojik altyapı oluşturmak üzere bu birleşik proteinleri eksprese eden kalıcı hücre klonları elde edilmiştir. Bu çalışma, fotokonversiyon özelliği gösteren dendra-reseptör füzyonunun elde edildiği, bu füzyon proteininin fonksiyonel olduğunun gösterildiği ve bu araç kullanılarak reseptörün hücre zarındaki tek yönlü hareketinin gözlenebildiği ilk çalışmadır.Çalışmada elde edilen bulgular şöyle özetlenebilir: 1) Reseptörün ligand bağlanma bölgesine yakın bir noktada VI. transmembran heliks üzerinde bulunan F282L mutasyonu b2-adrenoseptörü (Gs ve adenilat siklaza kenetlenmek bakımından) konstitütif olarak aktive etmektedir. 2) F282L-mutantının konstitütif aktivite özellikleri ve ligand bağlama paterni agonist ile bağlı reseptörü taklit ettiği düşünülen CAM mutantından farklı bulunmuştur. 3) F282L-b2-adrenoseptör mutantının hücresel dağılımı yine CAM mutantınınkinden (ya da yaban tipinkinden) farklı bulunmuştur. 4) Tüm reseptör türlerinin hücre zarında en az iki farklı difüzif havuz oluşturdukları saptanmıştır. Bu bulgular b-adrenoseptörün farklı moleküler aktivasyon mekanizmalarının olabileceğine ve reseptörün birden fazla aktif durumunun varlığına işaret etmektedir. F282L mutantının gözlenen bu özellikleri tezin son bölümünde bir kuramsal denge modeli çerçevesinde açiklanmıştır.Anahtar Kelimeler: b2-Adrenerjik Reseptör, Hücre içi Protein Trafiği, Mutasyon, Protein-Protein Füzyonu, Yeşil Floresan Protein.

A large part of the signals transferred between cells by neurotransmitters, hormones, autacoids are perceived by means of G protein coupled receptors (GPCR). One of the hottest areas of modern therapeutics is studying the signaling mechanisms of these receptors, which constitute the main target of drugs used in medicine (70% of all available therapeutics target the GPCR). In the present study, a relatively unknown constitutive activating mutation (F282L in human b2-receptor) was investigated on a comparative basis (with wild type receptor and CAM mutant) to contribute a better understanding of the molecular activation mechanisms of GPCR. HEK 293 cells were used for heterologue transfection and human b2-adrenoceptors (as a prototypical example of GPCR) were used as the experimental model. Ligand binding and signaling properties of F282L mutant, compared to wild type and CAM receptor were investigated in purified membrane preparations or in intact cells. In order to investigate intracellular distribution or trafficking of F282L mutant compared to wild type and CAM mutant, fluorescent protein (GFP or dendra) fusions with the relevant receptors types were obtained. Cell clones that stably express these fusion proteins were also obtained as a experimential tool. In this respect, the present study is the first one in the literature where a receptor-dendra fusion was constructed, expressed, and shown to be functional and photoconvertible. The latter property of the fusion protein allows one to investigate unidirectional motion of the receptor in plasmalemma.Results of the present study can be summarized as follows: 1) F282L mutation in human ß2-adrenoceptor in transmembrane helix VI at a position close to the ligand binding site lead to the constitutive activity of b2-adrenoceptor (in terms of activating Gs and adenylyl cyclase), 2) Constitutive activity and ligand binding patterns of the F282L mutant were different from that of CAM mutant, which has been considered to be imitating agonist- bound receptor. 3) Cellular distribution of F282L-b2-adrenoceptor was found to be different from that of CAM mutant. 4) For all kinds of b2-AR investigated here, two different diffusive pools (fast and slow) were observed in the cellular membrane. These findings indicate that the molecular activation mechanism of b2-adrenoceptor may not be unique and that b2-adrenoceptor may possess more than one active state. Such properties of F282L mutant were explained in the last part of this dissertation in a framework of an equilibrium model.Key words: b2-Adrenergic Receptor, Green Fluorescent Protein, Intracellular Protein Trafficking, Point Mutation, Protein-Protein Fusion