Farklı stres koşullarında Debaryomyces hansenii`den hücre dışı protein üretiminin incelenmesi

Abstract

Debaryomyces hansenii endüstriyel öneme sahip ekstremofilik bir mayadır. Deniz suyu, peynir, et, şarap, bira, meyve, toprak ve şekerli ürünler gibi düşük su aktivitesine sahip birçok ortamdan izole edilmiştir. Pek çok gıdanın üretiminde aroma verici ve istenmeyen mikroorganizmaları yok etmede yardımcıdır. D. hansenii endüstride peynir üretimi, et fermentasyonu, bazı değerli kimyasalların, litik enzimlerin ve alditollerin üretiminde kullanılır. Bu çalışmada, D. hansenii'nin farklı stres koşullarında çoğalması, hücre dışı protein üretimi ve protein dağılımını incelemek amacıyla, farklı glukoz derişimlerinde, sıcaklıklarda ve katkı maddelerinin varlığında üretimler gerçekleştirilmiştir. D. hansenii, UYM katı ve sıvı ön çoğalma ortamlarından pepton, maya özütü, malt özütü ve glukoz içeren protein üretim ortamlarına aktarılmıştır. Protein üretimi, çalkalamalı hava banyosunda gerçekleştirilmiş ve üretim ortamından t=0 anından itibaren belirli zaman aralıklarıyla örnekler alınarak hücre çoğalması spektrofotometrik olarak takip edilmiştir. Üretimin 24. ve 33. st'inde hücre dışı protein derişimi ölçülmüştür. D. hansenii'nin salgıladığı proteinler ileri analizler için ortamdan izole edilmiş ve 7 cm, pH 4-7 tutuklanmış pH gradyen (IPG) şeritleri ile birinci boyutta, sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile ikinci boyutta ayrılmaları sağlanmıştır. Elde edilen jeller Sypro Ruby ile boyanmış, Versa Doc (Biorad) görüntüleme sistemi ile fotoğraflanmış ve PD-Quest v8.0 programı ile kalitatif ve kantitatif analizleri yapılmıştır. Bu şekilde ortamlarda farklı ifade olan proteinler ile iki kat artan ve azalan proteinler belirlenmiştir. Analizi tamamlanan tüm spotlar jelden kesilmiş, tripsinizasyon işleminin ardından Matriks Yardımcı Lazer Desorpsiyon İyonizasyon sistemi ile kütle spektrumları elde edilmiş ve her proteinin kütle spektrumu Mascot arama motorunda peptid kütle parmak izi yöntemiyle analizlenmiştir. Yapılan çalışmada, en yüksek hücre derişimine (3,645 mg/ml) %1 glukoz içeren UYM ortamında 10 °C'de ulaşılırken, en yüksek hücre dışı protein derişimine (31,41 µg/ml) yine aynı ortamda ulaşılmıştır. Protein çeşitliliği açısından en yüksek değerlere, çoğalmanın 24. st'inde %20 glukoz içeren 30 °C'deki ortamda 228 spot ile ulaşılırken, 33. st'inde %1 glukoz içeren 20 °C'deki ortamda 113 spot ile ulaşılmıştır. Tüm analizler sonucunda 7 adet anlamlı protein tespit edilmiştir.

Debaryomyces hansenii is an extremophilic yeast of industrial importance. D. hansenii can be found in many habitats with low water activity, such as sea water, cheese, meat, wine, beer, fruit and soil as well as in high-sugar products. It provides aroma components in some food production and helps to prevent the growth of unwanted microorganisms. D. hansenii is used for cheese production, meat fermentation, production of some fine chemicals, lytic enzymes and alditols in industry. In the present study, different glucose concentrations, temperatures and additives were examined as stress conditions to observe their effects on D. hansenii growth, extracellular protein production and protein profile. D. hansenii was inoculated from solid and liquid UYM pre-culture media into protein production medium containing malt extract, yeast extract, pepton and glucose. Protein production was performed in a rotary shaker and samples were collected periodically to follow the yeast growth spectrophotometrically. Extracellular protein concentrations were measured at the 24th and 33rd hours of production. Secreted proteins were isolated from the medium for further studies and separated by their isoelectric points in 7 cm, pH 4-7 IPG strips as the first dimension and by their molecular weights in sodium dodesil sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) as the second dimension. Eventually, the gels were stained with Sypro Ruby, photographed with Versa Doc scanner (Biorad) and analyzed by PD-Quest v8.0 software, qualitatively and quantitatively. Thereby, the proteins which were expressed differently or disappeared under different stress conditions were detected. Once the analysis was completed, all spots in the gels were excised; and after tripsinization, their mass spectra were obtained with a matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) system. Each mass spectrum was then identified by searching the Swissprot protein database through Mascot search engine using peptide mass fingerprint method. As a result, the highest cell concentration (3,645 mg/ml) was reached in UYM medium containing 1% glucose at 10 °C; and the highest extracellular protein concentration (31,41 µg/ml) was also reached under same conditions. Protein diversity levels are the highest with 228 spots in UYM medium containing 20% glucose at 30 °C; and with 113 spots in UYM medium containig 1% glucose at 20 °C, at 24th and 33th h of cultivation, respectively. Among the matched proteins, 7 proteins were found to be significant.