Hücre kültürü pasajlarının PPR virus P geni düzeyinde etkisinin araştırılması ve tanısal amaçlı gerçek zamanlı reverz transkritaz polimeraz zincir reaksiyonu (rtRT ? PCR) protokollerinin geliştirilmesi

Abstract

Peste Des Petits Ruminants (PPR), paramyxoviridae ailesinde, morbillivirus alt grubunda yer alan, hayvansal gıda üretiminin önemli bir bileşeni olan küçük ruminantların Asya ve Afrika` da artan öneme sahip, yüksek enfeksiyöz ve bulaşıcı karekterde hızlı yayılım gösteren önemli viral bir hastalığıdır. Hastalık çoğu gelişmekte olan Asya ve Afrika ülkelerinde endemiktir ve % 90'a varan mortalite oranı ile seyreden salgınlar oluşturmaktadır. Etkenin teşhisine yönelik farklı serolojik ve moleküler teknikler zaman içinde önemli ilerlemeler kaydetmiştir. Etkenin en kısa zamanda ve en yüksek doğrulukta ortaya konması için geliştirilen en önemli tekniklerden biri `gerçek zamanlı' PCR sistemidir.Çalışmamızda kullanılan primer ve prob tasarımları tamamen 2001 yılında Türkiye'de izole edilen ve genom sekansı gen bankasına girilen PPRV/TU00 izolatı üzerinden yapıldı. PPRV'e ait olan N, P, L ve M gen bölgelerine spesifik primer ? prob tasarımlarını kullanarak tek adımda viral RNA'nın kantitatif olarak tesbitinin gerçekleştirilmesi amaçlandı. Buna yönelik olarak, anabilim dalımıza farklı zamanlarda ulaşan ve konvansiyonel RT-PCR testi ile pozitif bulunmuş olan 45 adet koyun ve keçiye ait kan, serum ve organ numuneleri kullanıldı. PPRV RNA'sının kantitasyonu için in vitro transkripsiyon ve enfektif partikül sayısı bilinen virus sulandırmaları kullanıldı. Plasmidlerden cRNA eldesi sırasında yaşanan sorundan dolayı titresi bilinen virus RNA `sının bilinen miktarda oluşturulan örneklerin döngü eşik değerlerine karşılık başlangıçtaki kopyalarının logaritmik konsatrasyonlarının olduğu standart doğrular oluşturuldu. Yapılan denemelerde L gen bölgesine spesifik primer ? prob dizaynları ile L geni için 1,65 × 101, P geni için 5,88 , M geni için 1,01× 101 ve N geni için 1,73 × 103 kopya/ml`ye kadar saptanabildiği gözlendi.Bununla beraber hastalığın çok ciddi sıkıntılar oluşturması uygun, etkin, sorunsuz aşı geliştirilmesine yönelik çalışmaların artmasına yol açmıştır. Çalışmamızın ikinci ayağı olarak virusun hücre kültürlerinde pasajlanması sonucu PCR ile çoğaltmış olduğumuz P geninde meydana gelen değişimlerin dizin analizi metodu yardımıyla incelenmesi ve tesbiti gerçekleştirildi. Ancak dizinler arasında değişimler gözlenmedi ve dizinlerin stabil oldukları tesbit edildi.

Peste Des Petits Ruminants (PPR) also known as sheep plague, caused by an agent belongs to morbillivirus genus of paramyxoviridae family, is a significant infectious, contagious, fast-spreading disease of the small ruminants which are the important source of livestock, with an increasing importance in Asia and Africa. The disease has an endemic course and outbreaks with 90% mortality rate can occur in most of the developing countries of Asia and Africa. There has been a significant progress in serological and molecular techniques for the diagnosis of the agent. One of the most considerable techniques which were developed to diagnose the agent in the shortest time period and also with the highest accuracy is Real time PCR. This is a rapid system to quantify the amplified products with a high sensitivity and certainty.The primers and probs used in this study were designed on the genome of the isolate PPRV/TU00 which was isolated in 2001 in Turkey and submitted on gene bank. We aimed the one step quantitative determination of viral RNA by using the primer and probs specific for N, P, L and M genes of PPRV. For this purpose blood, sera and tissue (organ) samples belong to 45 sheep and goat which were received by our department and found to be positive by using PCR were used. For quantitation of RNA of PPRV; each gene region was cloned into plasmids. Also dilutions of a virus of known titer was used for quantitation incase of the problems which can occur at this stage. Trials have showed that it is possible to detect with L gene specific primers and prob designs; for L gene; 1, 65 × 101, for P gene; 5, 88 , for M gene; 1, 01× 101 and for N gene; 1, 73 × 103 copy/ml. Due to the problem took place during cRNA acquisition from plasmids standard curves were created which have cycling threshold values of known amount of RNA samples from the virus of known titer correlative to logarithmic concentrations of starting copies. In addition because of the severity of the disease, the number of the studies, on developing suitable, efficient, trouble-free vaccines has increased.At the second stage of our study the changes on P gene as a result of passaging the virus in cell cultures which was amplified by PCR were examined by sequence analysis method. However no changes were observed amongst sequences and it was decided that the sequences are stable.