Sığır sütünde brucella ve listeria tanısı için PCR optimizasyonu

Abstract

Bu çalışmada, sığır sütlerinden Brucella abortus ve Listeria monocytogenes suşlarının moleküler tanısı için PCR koşullarının optimizasyonu amaçlandı. Bu amaçla, süt içerisindeki bileşenlerin PCR üzerine inhibitör etkileri ve onların neden olduğu inhibisyonlardan koruyan protokoller incelendi. Bu araştırma Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Moleküler Mikrobiyoloji Laboratuvarı'nda gerçekleştirildi.Bakterilerin sütle fiziksel ilişkilerini belirlemek için, belli sayıda bakteri ile inokule edilmiş sütlerin çeşitli fraksiyonlarından canlı bakteri sayımları yapıldı. Bu deneyler, B.abortus'un sütte homojen olarak dağıldığını gösterirken, L.monocytogenes'in çoğunlukla sütün yağ fraksiyonunda yoğunlaştığını ortaya koydu. Bakteriyel DNA ekstraksiyonunun optimizasyonu için, belli sayıda bakteri ile inokule edilen yağlı ve yağsız süt örneklerinde spin-kolon tekniği ve kaynatma yöntemi kullanıldı. Yağlı ve yağsız sütlerdeki Ca iyonlarının PCR üzerindeki etkisi, PCR'da kademeli konsantrasyonda Mg iyonları kullanılarak incelendi. Tüm reaksiyonlar, test edilen parametreler dışında, her bakteri için belli bir primer seti ve belli koşullarda gerçekleştirildi.Kaynatma ile DNA ekstraksiyon yöntemi, özellikle yağlı sütte L.monocytogenes olmak üzere, her iki bakterinin PCR'ında spin-kolon tekniğine göre daha iyi sonuç verdi. PCR da artan Mg konsantrasyonları ile, elektroforezde daha belirgin bantlar elde edildi. Bu sonuç, sütteki Ca iyonlarının PCR üzerinde inhibitör etkisi olduğunu düşündürdü. DNA kaynatma metodu ile ekstrakte edildiğinde, yağlı ve yağsız sütlerde PCR'ın B.abortus için minimal saptama limitleri sırasıyla 370 ve 340 cfu/ml oldu. Aynı ekstraksiyon yöntemi ile L.monocytogenes için yağlı sütteki minimal saptama limiti 40 cfu/ml olarak bulundu. Sonuç olarak, farklı bakterilerin süt fragmanları ile etkileşimi farklı olabileceğinden, PCR için sütten örneklemenin önemli olduğu düşünüldü. Ayrıca, kaynatma ile DNA ekstraksiyonu ve Ca'a göre yüksek Mg konsantrasyonunun, sütte bakteri tanısında PCR sonuçlarını olumlu olarak etkilediği anlaşıldı.

In this study, the optimization of PCR conditions for the molecular detection of Brucella abortus and Listeria monocytogenes from raw cow milk was aimed. For this purpose, the inhibitory effects of milk ingradients on PCR and protocols that reverse the inhibitory effect were investigated. This study was performed in Molecular Microbiology Laboratory of Veterinary Faculty at Ankara University.To detect physical interactions of bacteria with milk components, live bacterial counts were done from several fractions of milk experimentally inoculated with given concentrations of bacteria. These experiments showed that, while B.abortus homogenously distributed in milk, L. monocytogenes mostly concantrated in fatty fraction of milk. For optimization of bacterial DNA extraction, spin-colon technique and boiling methods were used for milk samples with and without fat, inoculated with given concentrations of bacteria. Inhibitory effect of Ca ions in milk with or without fat on PCR was investigated by using gradient concentrations of Mg ions in PCR. All reactions were performed with a particular primer set and a given condition for each bacteria, except tested parameters.DNA extraction with boiling method gave better results than spin-colon technique in PCR with both bacteria, particularly with L.monocytogenes in fatty milk. With increasing concentrations of Mg ions in PCR, better bands were obtained after electrophoresis. This result suggested that Ca ions in milk had inhibitory effect on PCR. When DNA was extracted by boiling method, minimal detection limits of PCR for B.abortus in milk with and without fat were 370 and 340 cfu/ml, respectively. Minimal detection limit for L.monocytogenes with same extraction method was 40 cfu/ml of fatty milk. In conclusion, it was suggested that sampling of milk for PCR is important since the different bacteria may interact with milk fragments. In addition, DNA extraction with boiling and high Mg ion concentration relative to Ca improve the outcome of PCR for detection of bacteria in milk.