XLalphas aracılı sinyal iletiminin incelenmesi

Abstract

GPKR'ler hücre dışından gelen sinyali G-proteinleri aracılığı ile hücre içine aktarırlar. G proteinleri dört grupta sınıflandırılır. Bunlardan biri olan Galfas'in alternatif ?splicing? yoluyla sentezlenen birden fazla varyantı bulunmaktadır. Bu varyantlardan en büyüğü ?Extra-large? Galfas'tir (XLalfas). XLalfas, N-terminal bölgesi dışında Galfas proteini ile aynı amino asit dizisine sahiptir. Fonksiyonel benzerliklerine rağmen XLalfas ve Galfas proteinlerinin N-terminallerinin farklı olması iki proteinin reseptör kenet ve aktivasyon özelliklerinin farklı olma olasılığını gündeme getirmektedir. Bu nedenle bu çalışmada HEK-293 ve 2B2 fibroblast hücrelerinde XLalfas proteininin sinyal iletim özellikleri GalfasL (Galfas'in uzun formu) proteini ile karşılaştırılarak incelenmiştir. Çalışmada elde edilen bulgular şöyle özetlenebilir. 1- İncelenen tüm reseptör ekspresyon düzeylerinde bazal durumda ya da ?inverse? agonist uyarısı ile hücre içinde biriken cAMP miktarının XLalfas'te GalfasL'e oranla daha yüksek olduğu olduğu saptanmıştır. 2- XLalfas ya da GalfasL arasındaki yanıt farkı kuvvetli agonist varlığında ortadan kalkmaktadır. 3- Parsiyel agonist uyarısında ise XLalfas ya da GalfasL arasındaki yanıt farkı, reseptör miktarına bağlı olarak değişmektedir. Düşük reseptör düzeyinde Xlalfas'ten GalfasL'e oranla daha fazla yanıt alınmasına karşılık, reseptör miktarının arttırılması ile iki G proteini arasındaki fark ortadan kalkmaktadır. 4- Kompetisyon bağlanma deneyleri XLalfas'in beta2adrenerjik reseptör'e (beta2AR) GalfasL proteininden daha yüksek afinite ile bağlandığını göstermiştir. Bu nedenle iki G proteini arasındaki sinyal iletim farklarının proteinlerin beta2AR'e farklı afiniteler ile bağlanmalarından kaynaklandığı düşünülmüş ve yapılan nümerik simülasyonlar bu görüşü desteklemiştit. Ayrıca, çalışmada aynı reseptöre bağlanan iki G proteininin sinyal özelliklerinin incelenmesi ile klasik ?Ternary? kompleks model yeniden değerlendirilmiş ve çalışmada gözlenen bulguların tamamının açıklanması için model üzerinde çeşitli değişiklikler yapılmıştır.

GPCRs transmit the extracellular signal to the cell?s interior by means of G proteins. Heterotrimeric G proteins are classified in four main categories. Among these, G?s which has multiple splice variants through alternative splicing. Extra-Large G?s (XL?s) protein is the largest splice variant of Galphas. Except the amino terminal, XLalphas has an identical amino acid sequence with Galphas. Despite the functional similarities between XLalphas and Galphas, their receptor coupling and activation properties may diverge due to the difference in their amino terminals. Therefore, in this study, we investigated signaling properties of XLalphas in comparison with GalphasL. The present results can be summarized as follows: 1- For all receptor expression levels, basal or inverse agonist induced adenylyl cyclase activity of the XLalphas was higher than the GalphasL. 2- The difference between XLalphas and GalphasL dissapeared when strong agonists were used. 3- In the presence of partial agonists difference between these G proteins was dependent on the receptor expression level. In low receptor expression, the adenylyl cyclase activity of XLalphas was higher than GalphasL. This difference dissapeared when the level of receptor expression was increased. 4- Competation binding studies showed that the affinity of XLalphas was higher than GalphasL to the beta2AR. This result suggests that signaling difference between XLalphas and GalphasL originates from different binding affinities of these G proteins to the beta2AR. Finally, the signaling properties of these two different Galphas proteins that couple to the same receptor gave us the opportunity to re-evaluate and modify the ternary complex model.