Escherichia coli`de heterolog rekombinant protein ekspresyonu sırasında oluşan stres yanıtının incelenmesi.

Abstract

Endüstriyel, tıbbi, yaşam bilimleri gibi araştırmalarda sıklıkla kullanılan protein ve türevlerinin eldesi için kullanılan heterolog rekombinant protein üretimi, modern biyoteknolojinin en önemli araçlarından birisidir. Bakteriyel ekspresyon sistemleri, kullanım kolaylığı ve düşük maliyeti nedeniyle tercih edilen sistemlerdir. Ancak, heterolog rekombinant protein sentezinin indüklenmesi, bakteri hücresinin homeostazını bozan bir stres kaynağıdır. Hücrenin bu strese verdiği yanıtların izlenmesi ve protein ekspresyon koşullarının bu yanıtların en düşük düzeyde ortaya çıktığı duruma getirilmesi, bakteriyel ekspresyon sistemlerinin daha etkin kullanımı için akılcı bir yaklaşım olacaktır. Bu tez çalışmasında, sık kullanılan bakteriyel ekspresyon sistemlerinden biri olan pET sistemi ile protein üretiminin Escherichia coli (E.coli) hücreleri üzerinde yarattığı stres ve bu strese verilen yanıt incelenmiştir. Bu amaçla, yeşil floresan proteini (GFP) geni, T7 promotoru arkasına yerleştirilmiş; protein ekspresyonu 28 ve 37°C sıcaklıkta gerçekleştirilmiştir. Ekspresyon esnasında bakteri hücrelerinde oluşan stres yanıtı, groEL, rseA, cspA, uspA, uspB, grpE ve pspA stres genlerinin transkripsiyon düzeylerinin ölçümü, floresan mikroskopi ile GFP sentezleyen toplam hücre kitlesi ve inklüzyon cismi oluşumunun değerlendirilmesi ile takip edilmiştir. Ayrıca, her iki sıcaklıkta indüklenen kültürlerden izole edilen çözünür haldeki proteinlerin elektroforetik bant profilleri, aynı kültürlerden saflaştırılamayan inklüzyon cismi fraksiyonu ile karşılaştırılmıştır. Düşük sıcaklıkta indüklenen kültürlerden, deneyin başlangıcında daha hızlı GFP ifadelenmesi ve inklüzyon cismi oluşumu gözlenmiş, ancak inkübasyon sonlandırıldığında daha az miktarda çözünür protein izole edilebildiği saptanmıştır. Bu kültürlerde groEL, rseA, cspA, uspA, uspB ve pspA transkripsiyonunun ilk bir saat içinde, grpE'nin ise dördüncü saatte, 37°C kültürlerine göre daha yüksek seyrettiği saptanmıştır. Düşük sıcaklıkta T7 promotoru ile indüksiyonun, hücrenin translasyonel sistemini doyurarak şaperon yetmezliğine yol açtığı, böylece 37°C kültürlerine göre daha az çözünür protein üretimine neden olduğu düşünülmektedir.

Heterologous recombinant protein production , which is used for producing proteins and their derivates that are widely used in industrial, medical and life sciences, is one of the most important tools in modern biotechnology. Bacterial expression systems are preferred because of their manipulation simplicity and low cost. Therefore, the induction of heterologous recombinant protein synthesis is the source of the stress that interferes with the homeostasis of the cell. Monitoring the bacterial responses to this stress and regulating the protein expression conditions to keep these responses at minimum are essential steps for using these bacterial expression systems effectively. In this thesis, the stress response which is formed by production of heterologous recombinant proteins via one of the most favoured bacterial expression system, pET system, in Escherichia coli (E.coli) is investigated. For this purpose; green flourescent protein (GFP) gene is cloned downstream of the T7 promoter; GFP is expressed in E.coli strains at 28 and 37°C. The bacterial stress response during the expression is investigated via measuring the transcription levels of stress genes like groEL, rseA, cspA, uspA, uspB, grpE and pspA; and monitoring the total cell volume and inclusion body formation in GFP-synthesized cells by florescent microscopy. Additionally, electroforetic bant profiles of soluable proteins isolated from bacterial cultures induced at both temperatures, are compared with unpurified inclusion body fractions of the same cultures. Transcription of GFP and inclusion body formation are faster in cultures induced at low temperatures at the begining of the experiment; but, less soluable protein can be isolated at the end. In these cultures, transcription level of groEL, rseA, cspA, uspA, uspB ve pspA during the first hour; and, grpE at the fourth hour are higher than cultures induced at 37°C. It is thought that protein induction via T7 promoter at low temperatures saturates translation system of the cell and causes the deficiency of molecular chaperones, so that less soluable protein can be produced at low temperatures than 37°C .