Haşhaş (Papaver somniferum L.) mikro-RNA larının (miRNA) tanımlanması ve miRNA hedef gen ekspresyon analizlerinin belirlenmesi

Abstract

Mikro-RNA lar (miRNA) 21 nukleotid uzunluğunda küçük, çoğu organizmada gen ifadesinde düzenleyici olarak rol alan ve kodlanmayan RNA?lardır. Haşhaş bitkisi özellikle narkotik morfin, öksürük kesici kodein ve kas gevşetici papaverin başta olmak üzere birçok çeşit benzilisokuinolin tipi alkaloiti üretebilen bir bitkidir. Şimdiye kadar alkaloit senteziyle ilgili birçok çalışma yapılmasına rağmen haşhaşta yer alan miRNA?larla ilgili hiçbir çalışma yapılmamıştır. Bu tez kapsamında haşhaşta yer alan ve alkaloit sentez yolağı ile ilişkili miRNA?ların saptanması amacıyla bir dizi çalışmalar yapılmıştır. Haşhaş bitkisinin çeşitli dokularına ait küçük RNA kütüphaneleri yüksek işlem hacimli Illumina Solexa teknolojisi ile dizilenmiştir. Toplam 11,999,328 küçük RNA okuması yapılmış bu okumalardan 2,999,700 tanesi benzersiz küçük RNA okuması olarak saptanmıştır. Derinlemesine dizileme teknolojisi yardımıyla toplam 12550 haşhaş miRNAsı saptanmış olup, bu miRNA?ların 124 miRNA familyasına ait olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca bu çalışma ile 7 adet haşhaşa özgü yeni miRNA bulunmuştur. Haşhaş transkriptomu için farklı doku örneklerinden izole edilen RNA?lar ile miRNA mikroarrayi uygulaması yapılmıştır. Derinlemesine dizileme teknolojisi ve miRNA mikroarray sonuçları bir araya getirilerek haşhaş bitkisinde miRNA profillemesi yapılmıştır. Haşhaşta ifade edilen bazı miRNA?lardan seçim yapılarak bu miRNA ve hedef genlerinin dokulardaki ifade düzeyi kantitatif gerçek zamanlı RT-PCR (qRT-PCR) ile doğrulanmıştır ve ölçülmüştür. Ayrıca haşhaşa özgü yeni miRNA?lar ile RNA?lar miR156, miR157, miR167 ve miR535?in hedef genleri 5?modifiye RLM-RACE metoduyla tespit edilmeye çalışılmış ve sonuçta pso-miR535?in alkaloit senteziyle yakından ilgili LOX genini hedeflediği bulunmuştur. Alkaloit sentez mekanizmasının haşhaş bitkisinde regülasyonunu sağlayan 23 adet miRNA bu çalışma kapsamında tespit edilmiştir. Bu miRNA?lardan pso-miR13 ve pso-miR408? in doğrudan alkaloit sentezinde yer alan genleri hedeflediği belirlenmiştir.

MicroRNAs (miRNA) are ~21 nucleotide long, small endogenous and non-coding regulatory RNAs. The opium poppy, Papaver somniferum L., produces several types of benzylisoquinoline alkaloids including the narcotic analgesic morphine, the cough suppressant codeine, the muscle relaxant papaverine, and the anti-microbial agents sanguinarine and berberine. Although there are many studies related to biosynthesis of alkaloids; no studies on the regulatory roles of miRNAs in opium poppy. In this thesis, several studies were conducted on determinnation of the miRNAs associated with alkaloid synthesis pathway in opium poppy. A small RNA library from different tissues of opium poppy was constructed and sequenced by the Illumina platform. A total of 11,338,273 small RNA reads were obtained. 1,047,447 total reads representing 12550 unique sRNAs were matched to known opium poppy miRNAs. These miRNAs were belong to 124 miRNA family. Since no homolog has been found for other plant species 7 novel miRNAs were considered to be species specific. miRNA transcriptome analysis, miRNA-microarrays by using sRNA samples isolated from different tissues of opium poppy were performed. Some of the miRNAs with significant expression levels were chosen and analyzed in detail. Expression levels of selected miRNAs in different tissues were validated by qRT-PCR. In addition, novel papaver miRNAs and miR156, miR157, miR167 and miR535 target genes were identified with a modified 5?RLM-RACE method. The LOX gene targeted by the pso-miR535 was found to be closely related to thealkaloid biosynthesis. On the other hand, 23 miRNAs identified as responsible for the regulation of alkaloid synthesis mechanism. Such miRNA target genes, pso-miR13 and pso-miR408 target genes were discovered that they are directly involved in the alkaloid biosynthesis .