Identification of differentially expressed micrornas and analysis of the genes regulated by them during lipotoxic endoplasmic reticulum stress

Abstract

Obezite, tip 2 diyabet ve ateroskleroz gibi metabolik düzensizliklerde serbest yağ asitleri, yağ dokusunun yanısıra başka dokularda da birikmektedir. Hücre içindeki serbest yağ asidi birikimine karşı koyamayan -yağ doku harici dokulardaki- hücrelerde Endoplazmik Retikulum (ER) stres ve lipotoksik hücre ölümü gerçekleşir. Katlanmamış Protein Yanıtı (KPY) hücrede biriken serbest yağ asitlerinin endoplazmik retikulumda meydana getirdiği stres durumuna karşı koymak için aktive olan bir mekanizmadır ve hücrenin ER'da oluşan strese karşı koyarak adaptasyonu veya hücrenin kendini apoptoza programlaması arasında anahtar rolü üstlenmektedir. Ancak, uzun süren ve çözümlenemeyen ER stresi, hücreler ve dokular için zararlıdır, ER stresi metabolik dokularda kronikleştigi zaman, metabolik hastalıkların gelişimine yol açmaktadır. Lipotoksisitenin KPY'nı hangi moleküler mekanizmalarla aktifleştirdiği ve KPY sinyal yolağının adaptif veya destrüktif yanıtlarının nasıl kontrol edildiği halen tamamen aydınlatılamamıştır. Son yıllarda tanımlanan ve gelişim, organogenez, kök hücre statüsünün idamesi, kanser gibi biyolojik süreçlerde rol alan mikroRNAların (miRNA), protein kodlayan genlerin yaklaşık %30-60'ını kontrol ettikleri tahmin edilmektedir. Lipotoksik ER stres kaynaklı KPY aktivasyonu sırasında ifadesi değişen miRNAları tanımlamak amacı ile fare makrofaj hücre hattında (RAW 264.7), lipotoksik ER stres oluşturulmuş ve ardından bu hücreler ve kontrol hücre hattının miRNAome profilleri, QRT-PCR temelli miScript miRNA PCR array kullanılarak biyolojik tekrarlı analiz edilmiştir. miRBase 16.sürümdeki tüm fare miRNAları ile yapılan taramada 227 adet miRNAnın ifade seviyesinde değişiklik gözlenmiş, 43 tanesinde 2 kat ve üzeri artma/azalma gözlenirken, 13 adetinde ise 3-24 kat artma/azalma görülmüştür. Lipotoksik ER streste ifadesi değişen bu miRNAların hedef transkriplerini belirlemek için yolak analizleri yardımı ile olası hedef mRNAlar belirlenmiş ve QRT-PCR ile ifade seviyeleri analiz edilmiştir.

During metabolic disorders such as obesity, type 2 diabetes and atherosclerosis, free fatty acids accumulate in fat tissues as well as other tissues. When there is excess fatty acid accumulation in the tissues other than fat tissue, ER stress and lipotoxic cell death takes place. Unfolded protein response (UPR) is a mechanism that is activated against the stress generated in endoplasmic reticulum by the accumulation of intracellular free fatty acids and UPR is the key mediator between the cells' adaptation against the ER stress or programming itself to apoptosis. Unsolved ER stress is harmful for the cells and tissues. It is still not completely clarified how lipotoxicity activates UPR and how the adaptive and destructive responses are controlled. It has been estimated that microRNAs which function during development, organogenesis, maintenance of stem cell status and cancer, regulates 30-60% of all protein coding genes. In order to identify the differentially expressed miRNAs during lipotoxic ER stress originating UPR activation, we have generated lipotoxic ER activation in mouse macrophage cell line (RAW 264.7) and analyzed the miRNAome profiles of this cell line and control cell line using QRT-PCR based miScript miRNA PCR array which contained all known mouse miRNAs in miRBase release 16. After analysis, 227 miRNAs showed altered expression levels; 43 miRNAs above 2 fold difference and 13 miRNAs 3-24 fold difference. Pathway analysis was performed in order to identify the target mRNAs of these lipotoxic ER stress associated miRNAs and the expession levels of these target mRNAs were investigated.