Rezene (Foeniculum vulgare) tohumundan fenol oksidaz enziminin saflaştırılması ve biyokimyasal karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada ekonomik bir bitkisel fenol oksidaz kaynağının bulunması ve enzimin olası uygulama alanlarının belirlenmesi için karakterizasyonu hedeflendi. Bu hedefle, rezene (Foeniculum vulgare) tohumundan enzim Üçlü-Faz Ayırma (TPP) sistemi ile ilk defa bu çalışmada saflaştırıldı ve karakterize edildi. Buna göre, %65 (w/v) (NH4)2SO4 ve 1,0:0,5 oranında enzim/t-bütanol içeren pH 6,0'da (25˚C) hazırlanmış sistemden fenol oksidaz enzimi orta fazda toplandı ve yaklaşık %120 geri kazanım ile 2 kat saflaştırıldı. Enzim alt biriminin molekül ağırlığı SDS-PAGE ile yaklaşık 21,8 kDa, optimum pH ve sıcaklık değerleri ise sırasıyla 7,0 ve 70°C olarak belirlendi. Enzimin Km ve Vmax değerleri sırasıyla 49 mM ve 909 U/mL olarak bulundu. Aktivite boyama sonrası saf enzimde lakkaz ve katekol oksidaz aktivitesi tespit edildi. %10 (v/v) konsantrasyonuna kadar organik çözücülerden etanol, aseton ve dimetilsülfoksit (DMSO) varlığında enzim aktivitesinin kontrole göre %80-84'ünün korunduğu tespit edildi. Ayrıca fenol oksidaz inhibitörü olarak bilinen salisil hidroksamik asit (SHAM), setriltrimetilamonyum bromit (CTAB) ve polivinilpirolidon (PVP) varlığında inhibisyon gözlendi. Sonuç olarak rezene bitki tohumlarının fenol oksidaz kaynağı olarak kullanılabileceği ön görülmekte ve bu bitkiden tek adımda gerçekleştirilen ekstraksiyon metodunun basit, güvenilir, ekonomik ve etkili bir metot olarak enzim preparatı hazırlamada kullanımı önerilmektedir.

In this study, it was aimed to produce phenol oxidase and characterize the enzyme for investigation of its possible application areas. Towards this aim, the enzyme has been purified by Three-Phase Partitioning (TPP) from the fennel (Foeniculum vulgare) seeds and characterized for the first time. Accordingly, the phenol oxidase enzyme has been partitioned to the interphase in the system prepared at pH 6.0 (25°C) by addition of t-butanol with the ratio of 1.0:0.5 (v/v) to the mixture containing crude extract saturated with 65% (w/v) (NH4)2SO4. Under these conditions, the enzyme has been 2.0-fold purified with a 120% activity recovery. The subunit molecular weight of the enzyme has been determined as 21.8 kDa by SDS-PAGE. The optimum pH and tepmerature, Km and Vmax values have been estimated as 7.0, 70°C, 50 mM and 909 U/ml, respectively. Purified enzyme has revealed both catechol oxidase and laccase activities after the activity staining. Up to 10% (v/v) concentration, some organic solvents like ethanol, acetone and dimethyl sulfoxide (DMSO) have been found to make the 80-84% of the initial activity remained. On the other hand, inhibition has been observed in the presence of salicyl hydroxamic acid (SHAM), cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) and polyvinylpyrrolidone (PVP), which are known as phenol oxidase inhibitors. As a result, it has been suggested that the fennel plant seeds can be used as a source of phenol oxidase and the single-step extraction method tested here provides a simple, reliable, economical and efficient way for enzyme preparation.