ΔNP63β geninin T98G hücreleri üzerindeki fenotipik ve genotipik özelliklerinin araştırılması

Abstract

P53 ailesi üyelerinden biri olan p63 yapısal olarak p53 ile benzer olsa da fonksiyonel olarak, oluşturduğu izoformlarıyla p53'den farklılıklar göstermektedir.Bu tezde, p53 ailesinin bir üyesi olarak bilinen, p63 proteinin izoformlarından biri olan, fonksiyonu tam olarak bilinmeyen ve henüz kayda geçmiş ayrıntılı literatür çalışması olmayan ΔNp63β'nın insan glioma kanser hücresi, T98G hücreleri üzerindeki fenotipik ve genotipik özellikleri incelendi. P63 proteinin tümör baskılayıcı olarak hücrede rol aldığı bilinmektedir. Bu nedenle ΔNp63β proteinin, T98G hücresinin fenotipi ve genotipinde oluşturacağı etkileri sürekli hücrelerde izleyebilmek için doksasiklin varlığında indüklenen pRetroX-Tet-On vektör sistemi kullanıldı. İlk olarak rtTA ifade eden bu vektör sistemi ile sürekli hücre hatları elde edildi ve bu hücre hattına ΔNp63β ifade eden pRetro-pur vektör sistemi transfekte edildi. ΔNp63β ifade eden bu hücre hattı kullanılarak bu proteinin hücre üzerindeki fenotipik ve genotipik etkileri incelendi.Literatür bilgilerine göre, p63 proteinlerinin, TA izoformları tümör baskılayıcı, ΔN izoformlarının onkojen olarak kabul edilmelerine karşın , ΔN izoformlarından biri olan ΔNp63β'nın T98G hücresindeki ifade artışı dramatik bir şekilde hücre ölümüne neden olmuştur. Gerçekleşen bu hücre ölümlerinin nedeni beklenildiği gibi apoptozisden değil ΔNp63β proteininin hücre sitotoksik etkisinden kaynaklandığı saptandı.ΔNp63β proteinin genetik etkilerini araştırmak amacıyla temel olarak p53 proteinin hedef genleri ve proteinlerinin ifade analizleri yapıldı. ΔNp63β'ın apoptozis ile ilgili genlerin ifadelerinde değişiklik oluşturmadığı buna karşın anti apoptotik genlerde artışa neden olduğu belirlendi. Ayrıca P53 ile ilgisi kanıtlanmış interferon (IFN) ve IFN tarafından regüle edilen genler olarak adlandırılan ve hücre defansında rol alan hedef genlerde p53'ün oluşturduğu genetik değişikliklere benzer değişiklikler ΔNp63β ifadesi artmış hücrelerde de belirlendi. Onkojenitede rol alan birçok gen ifadesi düzeyinde artış görünmesine rağmen ΔNp63β ifadesinin artığı T98G hücrelerinde gerçekleşen hücre ölümlerinin nedenlerinin ortaya konması için daha fazla araştırmaya gereksinim vardır.

P63 is described as a member of the p53 family. Although p63 resembles to p53 as structural and functional, it is different from the p53 because it has different isoforms.Although there are studies related with p63 isoforms, ΔNp63β that is an isoform of p63 are not presented in literature in detail. In this thesis the phenotypic and genetic effects of ΔNp63β on the T98G cell line was investigated.P63 is known as tumor suppressor protein. For this reason, to see the functions of ΔNp63β on continuous cell lines pRetroX-Tet-On vector system, which induced by the doxacillin, was used. First rtTA expressing vector that is part of the pRetroX-Tet-On vector system was established on the T98G cell lines with the presence of neomycine selection. Thereafter, ΔNp63β cDNA cloned Retropur Tight retroviral vector prepared and infected the T98G cell lines containing pRetroX-Tet-On vector system and continuous cell lines were obtained with the puromycin selection. Then, the functions of the ΔNp63β on the T98G cell line were investigated.Although TA p63s is described as tumor suppressor and ΔN p63 isoforms is described as oncogene in the limited number of literature, in this study, overexpression of ΔNp63β in the T98G cell lines killed cell dramatically. Interestingly, It was determined that cell death is due to the necrosis not as expected as due to apoptosis.Genetic effects of ΔNp63β was investigated basis on the expression analysis of the p53 target genes. It was found that while ΔNp63β has no effects on the apoptosis-related genes, it has changed the expression of the anti-apoptotic genes. In addition the apoptosis related genes, Interferon regulated genes which are regulated by p53 and have roles in cell defence were investigated. Results indicates that Expressions of IFN regulated genes showed similar patterns to the p53 results.Although ΔNp63β overexpression increased the some of the oncogenite releated genes, cell died dramatically. Further experiements are needed to explore the causing of cell death.