Türkiye kaynaklı peynir örneklerinden izole edilen Enterococcus cinsi üyelerinin biyofilm oluşturma özelliklerinin araştırılması

Abstract

Çalışmamızda ilk olarak peynir izolatı olan 15 adet Enterococcus faecalis ve 33 adetEnterococcus faecium izolatları ile, Enterococcus faecalis ATCC29212 ve Enterococcusfaecalis OG1RF kontrol suşularının biyofilm oluşum özellikleri incelenmiştir. E.faecalis izolatların %26.6' si biyofilm üreticisi iken geri kalan izolatların biyofilmüretim özelliğine sahip olmadığı belirlenmiştir. Bunun yanında, E. faecium izolatlarının%33'sının biyofilm üreticisi olduğu belirlenmiştir. 48 Enterokok izolatının MICdeğerleri incelendiğinde kanamisin antibiyotiğine karşı 48 izolatın tamamı dirençlibulunurken, izolatların %83.3' ü vankomisin antibiyotiğine karşı direnç profilisergilemiştir. Ayrıca biyofilm üreticisi olan izolatların tamamı planktonik formdaykengentamisine karşı duyarlı olmalarına karşın biyofilm ürettikleri durumlarda gentamisineyüksek düzeyde (32000 mg/L) dirençli hale geçmişlerdir. Benzer şekilde, izolatlarbiyofilm oluşturduklarında vankomisin antibiyotiğine dirençlerinin 16000 mg/L'yekadar yükselmiştir. Hidrofobisite sonuçlarına göre izolatların biyofilm oluşturmadüzeyleri ve hidrofobisite yeteneği arasında anlamlı bir ilişkiye rastlanmamıştır.İzolatların jelatinaz üretim denemesi sonucuna göre E. faecalis izolatları içerisinde dört(64, 72, 78, 140 kodlu izolatlar) güçlü proteaz (+++), ve üç (ATCC 29212, 79, 81 kodlusuşlar) negatif proteaz (-) ve kalan dokuz suş zayıf proteaz (+) özelliğinde suşsaptanmıştır. E. faecium izolatlarında ise bir suş (14 kodlu izolat) proteaz negatifbulunurken, diğer 32 izolatın tamamının zayıf proteaz (+) olduğu belirlenmiştir.İzolatların değişik glukoz konsantasyonda biyofilm üretimleri incelendiğinde; %0.1 ve%1.5'lik glukoz içeren TSB besi ortamında %0.5'lik glukoz içeren TSB besi ortamına göre daha yüksek miktar biyofilm ürettikleri görülmüştür. Morfotiplendirmedenemesinde Enterokok izolatları tarafından üretilen biyofilmlerin tamamının aynımorfotipte olduğu bulunmuştur. esp geni araştırılması sonucunda 48 suş arasında toplam4 suş esp genini sahip olduğu belirlenmiştir. esp geni bakımından pozitif bulunan iki E.faecalis izolatı (81 ve 119 kodlu izolatlar) ve iki E. faecium (60 ve 134 kodlu izolatlar)izolatları arasında biyofilm üreticisi olmadığı ve biyofilm üreticisi E. faecalis ve E.faecium izolatları arasında hiçbirinin esp genini içermediği tespit edilmiştir.Enterokokların yüzey proteini kodlayan esp geninin biyofilm üreticisi olmayan S.Typhimurium LT2'suşuna aktarımı sonucunda, bu genin S. Typhimurium LT2 suşundaifade edildiği qRT-PCR denemesi ile gösterilmiştir. Ayrıca bu bulgu, esp geninin Grampozitif bakteri proteini olmasına rağmen Gram negatif bir bakteride ifade olması ve dahaönce biyofilm üreticisi değilken, orta düzeyde biyofilm üreticisine dönüşmesi bakındanda önem taşımaktadır.

In this project, firstly, biofilm producing abilities of cheese originated 15 Enterococcusfaecalis and 33 Enterococcus faecium strains, and also Enterococcus faecalisATCC29212 and Enterococcus faecalis OG1RF control strains was investigated. 26.6%of E. faecalis isolates was biofilm producer while, the rest of were not able to producebiofilm. Besides these findings, 33% of E. faecium isolates was determined as biofilmproducers. Considering the MIC value of 48 enterococci isolate, all of tested 48 strainswere resistant against Kanamycin antibiotic and 83.3% of them were also exhibitedresistance profile against Vancomycin. In addition, despite of the entire biofilmproducer strains were resistant against Gentamicin antibiotic, they improved higherlevels of Gentamicin resistance (32,000 mg / L) after they form biofilm structure.Similarly, when isolates form biofilm, their resistance level to Vancomycin antibiotichad risen up to 16000 mg/L. According to results of hydrophobicity assay, there was noany significant relation was found between hydrophobicity and biofilm production ofthe strains. While considering results of gelatinase production experiments, we foundfour of E. faecalis isolates (64, 72, 78, 140 coded isolates) were strong protease (+++)and three of E. faecalis isolates (ATCC 29212, 79, 81 coded strains) were negativeprotease (-) and the remaining nine strains were detected as weak protease (+) property.Among E. faecium isolates, only one strain (14 coded isolates) was found as negativeproteases while the other 32 isolates was determined as weak protease (+). While weexamined the biofilm producing abilities of strains at different glucose concentrations,we found that while strains grown in TSB medium supplemented with 0.1% and 1.5% glucose they produced higher levels of biofilm compared to 0.5% glucose. All strainswere found to be in the same morphotype. As a result of the investigation for thepresence of esp gene among strains, this gene was determined in four of the isolates. Wefound that, none of the two E. faecalis isolates (81 and 119 coded isolates) and two E.faecium (60 and 134 coded isolates) isolates who contains esp gene were biofilmproducer, while none of the biofilm producer strains were contains esp gene. Followingthe clonning esp gene, encoding Enterococci surface protein, to non-biofilm producer S.Typhimurium LT2 strains, we shown by qRT-PCR that this gene is expressed in S.Typhimurium LT2. Also, these findings are important because esp gene is belong to aGram positive organism and can expressed in a Gram negative organism and thisorganism become intermediate level biofilm producer following the transforming thisgene