Fonksiyonel doku mühendisliği yöntemi ile iskelet kası geliştirilmesinde yağ kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin kullanılması

Abstract

Vücut ağırlığının yaklaşık yarısını oluşturan iskelet kası çeşitli nedenlerle sıklıkla hasar görmektedir. Her ne kadar iskelet kası, içeriğindeki kök hücrelerin aktivitesiyle kendini yenileme mekanizmasına sahip olsa da, özellikle büyük hacimli kas kaybı vakalarında rejenerasyon tam olarak gerçekleşememektedir. Bu gibi durumlarda iskelet kası rejenerasyonunun sağlanabilmesi için literatürde hücre taşıyıcılarının, kök hücrelerin, iyileştirmeyi arttırıcı faktörlerin kullanıldığı ve gen tedavisi yaklaşımının uygulandığı çeşitli çalışmalar mevcuttur. Ancak tüm bu çalışmaların kısıtlı başarısı, kas iyileşmesinde hücresel tedavilerin tek başına yeterli olmadığı, özellikle büyük hacimli kas kayıplarının iyileşme sürecinde fiziksel olarak da desteklenmesi gerekliliği ve hücrelerin doku iskeleleri ile beraber kullanılmasının etkin sonuçlar elde edilmesinde gerekli olduğu sonuçlarını işaret etmektedir. Bu noktadan hareketle, hücrelerin, doku iskelelerinin ve biyoaktif moleküllerin bir arada kullanılmasıyla kaybedilmiş veya zarar görmüş dokuların onarılması ya da değiştirilmesi amacıyla biyolojik sistemler geliştiren disiplinlerarası bir araştırma alanı olan doku mühendisliği, fonksiyonel bir kas grefti geliştirilmesi için büyük önem taşımaktadır.Bu tez çalışması, iskelet kasının doğal yapısını taklit edecek şekilde paralel yönlenmiş fiber yapıların üretilmesine ve bu fiberlerin içerisine yerleştirilen yağ kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (ASC) serbest ve yönlenmiş durumda, statik ve dinamik hücre kültürü koşullarında miyojenik farklılaşma kapasitesinin araştırılmasına odaklanmıştır. Dolayısıyla bu tez çalışmasında, yapısal ve fizyolojik olarak kas mikroçevresinin taklit edilmesi amacıyla ASC içeren fibrin fiberlerin yönlenme ekseninde periyodik gerilme uygulanarak ASC miyojenik farklılaşması sağlanması ve 3 boyutlu fonksiyonel kas grefti geliştirilmesi amaçlanmıştır. Üretilen fibrin temelli fiberlerin kas mikroçevresini taklit edecek sertlikte olduğu ve bunun fiberler içinde hücre büyümesi ve paralel yönlenmesiyle arttığı belirlenmiştir. Serbest fiberler içlerinde hücre olsa dahi paralel yönlenmenin sağlanamaması nedeniyle 8-10 kPa sertliğe sahiptir fakat bu sertlik doğal kas yapısı için yeterli değildir. Hücreli ve yönlendirilmiş fiberler ise yeterli sertlik olan 12 kPa üzerinde bir sertliğe sahiptir.ASC miyojenik farklılaşmasının sağlanması için 5-azasitidin ile kimyasal indükleme uygulanmıştır. 5-azasitidin uygulanan örneklerde hücre çoğalması uygulanmayanlara göre yavaş seyretmiştir. Statik kültürde miyojenik belirteçlerin tayini için yapılan immünfloresan boyama sonuçlarına göre kimyasal indükleme tek başına yeterli olmamıştır. Kas mikroçevresinin yapısal olduğu kadar mekanik olarak da taklit edilmesi için uygulanan dinamik kültür koşullarında ise hücreler statik kültüre göre daha düzensiz hizalanmış olsalar da yapılan immünfloresan boyama sonuçlarına göre kas spesifik belirteçleri olan MyoD-1, Desmin ve Myogenin'i 21 günlük deney periyodunda artan oranda ifade ettiği belirlenmiştir. Sonuç olarak, kimyasal olarak indüklenen ASC hücrelerinin dinamik kültür ortamında statik kültür ortamına göre kas spesifik belirteçleri göstererek miyojenik farklılaşma yolağına girdikleri gösterilmiştir.

The skeletal muscle that constitutes of almost half of the body weight is often damaged for various reasons. Despite the fact that skeletal muscle has a self-renewal mechanism by the activity of its stem cells, regeneration is never absolute, especially in situations such as volumetric muscle loss. In such cases, there are various studies in the literature to obtain skeletal muscle regeneration, using scaffolds, stem cells, growth enhancing factors and gene therapy. However, it is observed that cellular therapy alone is not sufficient for muscle healing, and regeneration of large volume muscle loss should also be physically supported during the healing period, and that cells used together with scaffolds are more effective. From this viewpoint, tissue engineering, an interdisciplinary field that develops biological systems for repairing or replacing lost or diseased tissues using cells, scaffolds, and bioactive molecules together, is of great importance for the development of functional muscle grafts.This thesis focuses on the production of the aligned fiber structures that mimic natural skeletal muscle and investigation of the myogenic differentiation capacity in static and dynamic cell culture conditions in the free and aligned fiber of adipose derived mesenchymal stem cells (ASC) encapsulated within these fibers. Therefore, in this thesis, it was aimed to provide ASC myogenic differentiation and to develop 3D functional muscle graft by applying periodic stress on the orientation axis of ASC-laden fibrin fibers in order to imitate the structural and physiological muscle microenvironment.It has been determined that the fibrin-based fibers produced are stiff enough to mimic the muscle microenvironment and that stiffness increases with cell growth and parallel orientation in the fibers. Because of the inability to provide parallel orientation, in spite of with cells, free fibers' stiffness is 8-10 kPa. So this stiffness is not enough for natural muscle structure. Contrary to free fibers, aligned fibers' stiffness is more than 12 kPa due to cell alignment.Chemical induction with 5-azacitidine was applied to ensure ASC myogenic differentiation. Induced cells proliferation was slower than uninduced ones and according to the results of immunofluorescence staining for identification of myogenic markers in static culture, chemical induction alone was not sufficient for myogenesis.ASC-laden fibers, in order for the muscular microenvironment to be imitiated mechanically as well as structurally, was dynamically cultured. Even though the cells are more irregularly aligned than the static culture, that was expressed MyoD-1, Desmin, and Myogenin, which are muscle specific markers.In conclusion, the studies have shown that chemically induced ASC cells in the dynamic culture according to in the static culture have been entered myogenic differentiation pathway by showing muscle specific markers.