Pseudomonas aeruginosa (PAO1)susunun değişik ısı ve değişik üreme fazlarında housekeeping gen anlatımı düzeyleri

Abstract

P. aeruginosa PA01 standart kökeninin ve dört ayrı hastaneden eldeedilmiş dört P. aeruginosa klinik kökeninin 8 housekeeping geni 37 ve 42derecelerde Brain-Heart Infusion, Mueller-Hinton ve Tryptic Soy Broth sıvıbesi yerlerinde ve ayrıca dört değişik NaCl yoğunluğunda mRNA anlatımlarıaçısından gerçek zamanlı PZR deneyi ile ölçüldü. Amaç değişen koşullarakarşın anlatımı en istikrarlı genleri seçmek ve mRNA anlatımları açısındanbağıl nicelik kıyaslaması yapmayı hedefleyen gelecek çalışmalarda bu istikrarlıgenlerin gerçek zamanlı PZR deneylerinde iç kontrol olarak kullanımınıönermektir.Bu amaçla PA01 genomundan Oligo 5.0 programı yardımı ile proC,fabD, rpoD, rpoS, oprB, rodA, rpoB ve fonksiyonu bilinmeyen gen x1 seçilerekbunları hedef alan primer dizileri belirlendi. Total RNA izolasyonu asit-fenolguanidine metodu ile izole edilip Random Hexamer Primerleri aracılığı ilecDNA ya çevrildi. Deneyler 570C derece annealing ısısı kullanılarak ve SYBRGren I boyasının ışıma miktarları 840C da ölçülerek yapıldı. Deneylerde eldeedilen ?Crossing Point? değerleri Bestkeeper ve NCSS programları aracılığı ileistikrarlılık ve birbirleri ile uyum açısından değerlendirildi.proC ve rpoD genleri hem PA01 standart köken için hem de dört klinikizolat için en istikrarlı ve birbirleri ile uyumlu genler olarak bulundu. Bugenlerin P. aeruginosa ile yapılacak bağıl nicel kıyaslama amaçlayan gerçekzamanlı PZR deneylerinde iç kontrol olarak kullanılmaları önerildi.Anahtar kelimeler: P.aeruginosa, ç kontrol, Housekeeping gen, mRNA, Gerçekzamanlı PZR

Expression stability of 8 Housekeeping genes of P. aeruginosa PA01 and offour other clinical strains of P. aeruginosa isolated in four different hospitals werestudied with real time PCR methodology after incubating these strains in 37 and 42degrees centigrade in Brain-Heart Infusion, Mueller-Hinton and Tryptic Soy brothmedia and additionally in broth media with different NaCl concentrations. This studyaimed to find most stable genes to be used in future studies as internal controls forrelative quantification of mRNA expressions of genes in P. aeruginosa.For this purpose, primers were designed by the aid of Oligo 5.0 for proC,fabD, rpoD, rpoS, oprB, rodA, rpoB and an unknown porin like gene x1 of thegenome of PA01. Total RNA from strains was isolated by the acid-phenol guanidinemethod and transcribed to cDNA by Random Hexamer Primers. PCR cycles wereaccomplished by an annealing temperature of 570C and the readings for SYBR GreenI dye were at 840C. Crossing points were evaluated for stability and correlation toeach other by the softwares Bestkeeper and NCSS.Both in PA01 and in clinical strains proC and rpoD genes were the moststable genes. This study suggested using these genes as the internal control ofrelative quantifications of genes in P. aeruginosa by real-time PCR method.Key words: P. aeruginosa, Internal control, Housekeeping gene, mRNA, Real-timePCR