Özgün bir ışık kontrollü T7-promotoru-GFP ifade sisteminin geliştirilmesi ve GFP ifadesinin incelenmesi

Abstract

Mikrobiyal biyoteknolojinin önemli alanlarından biri sentetik biyoloji ve genetik mühendisliği araçları kullanılarak mikrobiyal hücre fabrikaları ile rekombinant protein üretimidir. Sentetik biyoloji araçları birçok vektör ve genetik devreyi içermektedir. Bu çalışmada pDawT ve pATG adı verilen iki farklı genetik mühendisliği aracı olan vektör üretilmiş ve test edilmiştir. Bu iki vektör aynı mikrobiyal hücre içerisine ko-transforme edilip pDawT+pATG genetik devresi tamamlanmıştır. pDawT plazmidinden T7 RNA polimeraz enzimi ~400nm uzun dalga UV ışığı indüklenmesi ile üretilmekte ve üretilen T7 RNA polimeraz, pATG plazmidi üzerinde bulunan PT7 promotorundan, bu promotorun kontrol ettiği genin transkripsiyonunu başlatmaktadır. Bu çalışmada E. coli DH5α bakterisinde, PT7 kontrolünde EGFP üretilmiş ve hücreler FITC filtresinde floresan mikroskop ile görüntülenmiştir. Görüntülenen hücrelerin RGB ve HSV piksel yoğunluğu ve dağılımı analiz edilmiş ve karşılaştırılmıştır. Üretilen pDawT+pATG genetik devresi ile birçok farklı bakteri veya mayada kullanılabilecek özgün bir optokontrollü rekombinant protein üretim aracı üretilmiştir.

Recombinant protein production with microbial cell factories using synthetic biology and genetic engineering is one of the hot topics of microbial biotechnology. Many vectors and genetic circuits are used as synthetic biology tools. In this thesis study, we have produced plasmids pDawT and pATG as two different genetic engineering tools for recombinant protein production. pDawT+pATG genetic circuit is completed by co-transforming these plasmids into microbial cell factories. pDawT component of this genetic circuit is responsible for transcription of T7 RNA Polymerase gene by inducing with ~400nm long range UV. The produced T7 RNA polymerase enzyme then initiates the transcription of EGFP from PT7 promoter of the second component of the genetic circuit, pATG plasmid. In this thesis study we produced EGFP with pDawT+pATG genetic circuit in E. coli DH5α and visualized the cells under fluorescent microscopy via FITC filter. After imaging of the cells, the images' RGB and HSV pixel density and distribution are analyzed and compared. With the produced pDawT+pATG genetic circuit, a novel opto-regulated recombinant protein production tool is produced that can be used widely.