İnsan yağ dokusu kaynaklı mezenkimal kök hücreleri ile yüklenmiş hyaluronik asit/jelatin plazma jellerin yumuşak doku mühendisliği uygulamalarında kullanımı

Abstract

Plastik ve rekonsruktif cerrahide ve kalp yetmezliği ile ilgili hastalıklarıntedavisinde sayısız yumuşak doku mühendisliği temelli uygulamalar bulunmaktadır.Sadece hücre enjeksiyonu ile yapılan hücre transplantasyonlarında hücre-hücre dışı matriks(HDM) etkileşiminin yetersiz olmasından kaynaklanan fonksiyonel bozukluklar vetransplantasyonda yeterli sayıda canlı hücre olmamasından kaynaklanan sorunlar meydanagelmektedir. Laboratuvar ortamında büyüme faktörlerinin yanı sıra kök hücrelere çeşitlimikroçevre özelliklerinin sağlanması ile hedef hücre farklılaşması daha verimli bir şekildegerçekleştirilebilmektedir. Bu çalışmanın amacı insan kanı plazmasından yoğunlaştırılmışfibrinojen, jelatin ve göbek bağı türevli hyaluronik asit (HA) ile üç boyutlu iskelenin invitro testler ile yumuşak doku mühendisliği uygulamalarındaki uygunluğunun test edilmesive jel üzerine ekilen adipoz doku kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (AD-MKH) yağ vekalp kası hücrelerine farklılaşma potansiyelinin incelenmesidir. Öncelikle, jelatin, HA veinsan kanı plazmasından fibrinojenin çöktürülmesi ile hyaluronik asit/ jelatin plazma jeller(HA/J plazma jel) üretildi. Gluteraldehit ile çapraz bağlanmış jellerin sıkıştırma testi ilemekanik özellikleri incelendi ve kriyokesitleri alınan jeller komasi mavisi ile boyanarakjellerin gözenekliliği ve gözenek çapı belirlendi. HA/J plazma jellerin elastik modüllerininyumuşak dokuların elastik modüllerine yakın, 3.53±0.23 kPa, olduğu belirlendi. HA/Jplazma jellerin sade plazma jellere göre daha yüksek gözenekliliğe sahip olduğu belirlendi(% 72.5 ±5.85, % 63.86±4.27).İnsan lipoaspirat materyalinden AD-MKH'ler izole edildi ve üçüncü pasajda akımsitometri ile ve osteojenik ve adipojenik farklılaşma yapılarak karakterize edildi. Jel vecam slayt üzerine ekilen hücrelere WST-1 testi yapıldı. HA/J plazma jel üzerindeki ADMKH'lerin cam slayt üzerindeki hücrelere göre zamanla daha fazla çoğaldığı ve jelintoksik etkisinin olmadığı belirlendi. Sonrasında, jel üzerindeki AD-MKH'lerin adipojenikve kardiyomiyojenik farklılaşma potansiyeli incelendi. Jel üzerindeki AD-MKH'lerin yağhücrelerine farklılaştığı görüldü. Kardiyomiyojenik farklılaşmaya alınan hücrelerin 2 ve 3hafta sonra gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonları (PZR, Real-Time PCR) testi ileözel kalp kası genleri olan GATA4, TBX5 ve cTn I genleri HA/J plazma jellerin veaktivin-a, BMP-4, insulin, valproik asit ve 5-azasitidin gibi çeşitli kimyasal maddelerinetkileri karşılaştırmalı olarak incelendi. Gerçek zamanlı PZR sonuçlarına göre jel ve camslayt üzerindeki hücrelerin farklı kimyasal maddeler ile her bir gen için ekspresyon oranlarıfarklı bulundu. viSonuç olarak, HA/J plazma jellerin yumuşak doku mühendisliği uygulamaları içinuygun gözenek büyüklüğüne, mekanik özelliklere sahip olduğu ve hücre büyümesinidesteklediği belirlenmiştir. Ayrıca bu çalışmada, aktivin-a, BMP-4 ve insulin, valproikasitin 5-azasitidine göre jel üzerindeki AD-MKH'leri daha fazla kardiyomiyojenikfarklılaşmaya yönlendirdiği belirlenmiştir.

Soft tissue engineering-based approaches have numerous potential applications inplastic and reconstructive surgery and treatments of diseases related to heart failure. Celltransplantation through direct cell injection are not optimal for cell survival and functiondue to the lack of cell-ECM interactions. More efficient differentiation to target cells isachieved in the laboratory with the provision of various microenvironmental featuresbesides the growth factors to stem cells. The purpose of this study was to evaluatecardiomyogenic and adipogenic differantiation potantial of Adipose derived stem cells(AD-MSCs) on gels and the suitability of 3D scaffolds, composed concantrated fibrinogenfrom human plasma, gelatin and human umbilical cord derived hyaluronic acid, for softtissue engineering applications through in vitro tests. Fibrinogen was precipitated fromhuman plasma and its composite gels with gelatin and hyaluronic acid (HA/G plasma gels)were produced afterwards. Mechanical properties of the glutaraldehyde crosslinked gelswere determined with compression tests and their porosity and pore size determined fromtheir cryosections stained with commassie brilliant blue. The Young Modulus of the HA/Gplasma gels was determined as 3.53±0.23 kPa, close to that of soft tissues. The HA/Gplasma gels had higher porosity than plain plasma gels (72.5%±5.85vs 63,86%±4.27). ADMSCs were isolated from human lipoaspirates and characterised with flow cytometry at thethird passage, and also were differentiated into osteogenic and adipogenic lineages. ADMSCs were seeded on the gels and coverslips for comparative cell proliferation tests. Thecell proliferation assay (WST-1) of AD-MSCs on the HA/G plasma gels revealed thenontoxic nature of the gels and that the number of cells on the gels increase more rapidlythan on the coverslips in time. After, adipogenic and cardiomyogenic differentiationcapability of AD-MSCs on the gels is being investigated. Adipogenic differentiation ofASCs on gels were better than AD-MSCs of cover slips. After two and three weeks ofincubation for cardiomyogenic differentiation, the specific cardiac genes expressions ofGATA4, TBX5 and cTn I were examined by real-time quantitative polymerase chainreaction (real-time PCR) analysis to investigate the effects of HA/Gelatin blood plasmagels and the chemical modifiers like activin-a, BMP-4, insulin, valproic acid and 5-azacytidine on cardiomyogenic differentiation of AD-MSCs. Real time RT-PCR resultsshowed that different ratios cardiac markers' expression of cells seeded on gels andcoverslips (GAT 4, TBX5 and cTn I) caused every chemical modifiers. The results showedthat a composite HA/Gelatin plasma gel with suitable pore size, mechanical properties and viiiexcellent cell growth supporting property can serve as a useful scaffold for soft tissueengineering applications . Also cardiac gene expressions of the activin-a, BMP-4 andinsulin, valproic acid induced cells compared with 5- azacytidine induceed cells on HA/Gplasma gels were the most pronounced in promoting cardiomyogenic differentiations inthis investigation.