Yabanıl tip parkin ifade eden insan nöroblastoma hücrelerinde fosfoproteom analizi

Abstract

AmaçBu çalıĢmanın amacı; SH-SY5Y nöroblastoma hücre hattında Yabanıl tip (WT) vemutant Parkin proteinlerinin (Q311R ve A371T) ifadesi sonrasında oluĢan fosforilasyondüzeyindeki değiĢiklikleri proteomik yaklaĢımlarla araĢtırmak, ubikitinlenme vefosforilasyon arasındaki çapraz etkileĢime ıĢık tutmaktır.YöntemHücrelerden elde edilen protein özütleri iki boyutlu jel elektoforezi ile ayrıĢtırıldı.Fosforile olmuĢ proteinler ProQ Diamond boyası ile tayin edilerek protein spotlarıjellerden kesildi ve ardından, proteinler MALDI-TOF/TOF analizi ile tanımlandı.BulgularWT ve mutant tetrasiklin indüksiyonu yapılmıĢ ve yapılmamıĢ hücrelerden eldeedilen proteinlerden 2D tabanlı karĢılaĢtırmalı spot analizi yapıldı. Fosfoprotein boyamasısonrasında jellerde 35±3 fosforillenmiĢ protein spotu, toplamda ise Sypro boyamasısonrasında 215±15 protein spotu gözlenmiĢtir. WT Parkin ifade eden hücrelerde 10,mutant Parkin ifade eden hücrelerde ise 6 proteinin fosforilasyon seviyelerinde indüksiyonsonrası artıĢ olduğu görüldü.SonuçBeklentimiz WT Parkin indüksiyonunun ubikuitinlasyonunu arttırarak ubikitinlenmeve fosforilasyon arasındaki çapraz etkileĢimi baskın hale getirmesi ve dolayısıyla dolaylıyoldan fosforilasyon iliĢkili yolakların düzenlenmesi yönündedir. Nitekim STRINGanalizinin PI3K-AKT yolağını iĢaret etmesi ubikuitin bağımlı fosforilasyon ĢemasınındeğiĢtiğini göstermektedir. Diğer taraftan mutant Parkin indüksiyonu sonrasındatanımlanan fosforile proteinlerin ise Parkinson hastalığı ve endoplazmik retikulumdaprotein iĢlenmesi ile ilgili sonuçlar alınmıĢtır. WT ve mutant Parkin eksprese edenhücrelerdeki farklı hücresel yolakların ön plana çıkması mutant Parkin'in normal WT'egöre farklı fonksiyonu olduğunu göstermiĢtir.Anahtar Sözcükler: Parkin, SH-SY5Y, 2DE, Protein Fosforilasyonu, ProQ Diamond,MALDI-TOF/TOF.

ObjectiveThe purpose of this thesis was to investigate the changes in phosphorylation levelsin SH-SY5Y neuroblastoma cell line after expression of the Wild-type and the mutantParkin proteins (Q311R and A371T ). Determination of the changes in phosphorylationlevels upon Parkin expression should allow elucidation of the cross-talk betweenubiquitinilation and phosphorylation.MethodsThe protein extracts prepared from Parkin expressing and non-expressing cells wereprepared and subjected to 2D gel electrophoresis. Phosphorylated proteins were detectedby ProQ Diamond stain and differentially regulated protein spots were excised from thegels. Then, the proteins were identified by MALDI-TOF/TOF analysis.ResultsConsequtive phosphoprotein and total protein staining of the gels revealed theprecense of 35±3 phosphoprotein spots and 215±15 total protein spots on the gels. A totalof 16 phosphoprotein spots of which 10 belonged to the WT Parkin expressing cells and of6 beloged to the mutant Parkin expressing cells were identified as differantially regulated.ConclusionsThe induction of the WT Parkin expression should increase ubiquitinilation events inthe cells and stimulate the cross-talk between ubiquitination and phosphorylation. Indeed,STRING analysis linked the regulated proteins to PI3K-AKT pathway, which is one of themost important signaling pathways regulating cell division. On the other hand, the resultsof phosphorylated proteins which had been identified after an induction of the mutantParkin protein were found to be related to Parkinson's disease and endoplasmic reticulumprotein processing. Observation of such difference in indicated pathways upon either theWT or the mutant Parkin expressions may imply that the mutant Parkin protein isfunctionally different then the WT Parkin protein.Key words: Parkin, SH-SY5Y, 2DE, Protein Phosphorilation, ProQ Diamond, MALDITOF/TOF