Küçük molekül yapılı analitlerin piezoelektrik immunobiyosensörler ile tespitinde duyarlık geliştirilmesi

Abstract

Amaç: Toksinler, pesitisitler, organik toksik kimyasallar ve farmasötikler olarak günlük hayatta sıkça karşımıza çıkmakta olan küçük moleküllerin (analit), sağlık ve çevre üzerindeki zararlı etkileri nedeniyle izlenmelerine yönelik düzenlemeler yapılmıştır. Bu tür moleküllerin insan ve hayvan sağlığı ve çevre üzerine olumsuz etkilerinin önüne geçilmesi için etkin bir şekilde izlenmelerinde kullanılan rutin analitik sistemlere kıyasla, biyosensörler alanda hassas, kolay ve hızlı tarama imkânları sunabilmektedirler. Biyosensörlerin sağlayacakları olumlu sonuçlara bağlı olarak yaygınlaştırılmaları amacıyla analitik yöntemlerle karşılaştırıldıklarında, özellikle küçük moleküllerin tespitinde duyarlık açısından sınırlılıkları olduğu görülmektedir. Bu nedenle küçük moleküler yapıya sahip analitlerin, laboratuvar odaklı analitik cihazlara bağımlılığın azalarak yerinde hızlı bir şekilde tespitine yönelik biyosensör geliştirme çalışmaları analizlerin sıklaşması ve izlemenin yaygınlaşması açısından önem taşımaktadır. Bu çalışmada, önemli gıda kirleticileri olan küçük kimyasal yapılı mikotoksinlerin, gıda ve yem örnekleri laboratuvara taşınmadan yerinde tespitine yönelik piezoelektrik immünobiyosensörlerle duyarlılığı artırabilecek yöntem geliştirilmesi hedeflenmiştir. Yöntem: Yöntem geliştirme çalışmaları kapsamında antikor immobilizasyonu, analit-protein konjugatı immobilizasyonu ve analitin kovalent olarak immobilizasyonu stratejileri değerlendirilmiştir. Ardından duyarlık geliştirilmesi amacıyla antikorun PBM321 dendronuna konjugasyonu ile ağırlaştırılması ve valensisinin artırılması ile 5 MHz QCM'e göre daha yüksek frekansta ölçüm yapabilen 120 MHz Love wave ölçüm platformu kullanılması stratejileri değerlendirilmiştir. Çalışmada, mikotoksinler içinde en yüksek toksisiteye sahip AFB1 ve OTA küçük analit modeli olarak seçilmiş ve Anti-AFB1 ve Anti-OTA antikorları kullanılarak tespit edilmelerine yönelik yöntem geliştirilmiştir. Bulgular: Ölçüm platformu olarak 5 MHz QCM kullanılarak 17,2 ppb hassasiyetle OTA immünosensörü geliştirilmiştir. Küçük analitlerin tespitinde duyarlılığın artırılmasına yönelik gerçekleştirilen diğer çalışmada ise, Ertekin ve diğerleri (2016) tarafından 5 MHz QCM ile 1,25 ppb olarak geliştirilen AFB1 belirleme duyarlılığı, 120 Mhz Love wave ölçüm platformu kullanılarak 0,25 ppb'ye, PBM321 konjugasyonu ile 0,0002 ppb'ye kadar düşürülmüştür. Sonuç: AFB1 gibi küçük bir kimyasalın piezoelektrik biyosensörlerle tespitinde 6250 kat daha yüksek duyarlığa ulaşılmıştır. Bu çalışma TÜBİTAK MAM Tarafından `Çoklu Toksin Deteksiyonu Sağlayan Biyosensör Geliştirilmesi (MAMBİYOSENS 5133101) Projesi` ile desteklenmiştir.

Objective: Small molecules are widely encountered analytes in daily life and divided into four main classes such as toxins, pesticides, organic toxic chemicals and pharmaceuticals. Although there are regulations for monitoring of many small molecules due to their impact on health and environment; sensitive, easy and fast on-site detection devices such as biosensors need to be developed and generalised for effective monitoring and prevention of these molecules. However many biosensor studies have limitations in detection of small molecules when compared to analytical methods. Thus studies focusing on enhancement of sensitivity in detection of small molecules with biosensors provide the advantage of lower dependency to laboratory based analytical devices and generalisation of monitoring. Method: This study consists of two parts as method development and enhancement of sensitivity for detection of small molecules with piezoelectric immunobiosensors. Within the context of method development immobilization of antibody, analyte-protein conjugate and analyte was evaluated. Then mass and valency of the antibody was increased by conjugation to PBM321 and measurements were made by using 120 MHz Love Wave that can make measurements at higher frequencies when compared to 5MHz QCM in order to enhance the sensitivity. 5 MHz QCM was used in the studies carried for detection of selected model mycotoxins AFB1 and OTA by using Anti-AFB1 and Anti-OTA. Results: In this study OTA immunobiosensor was developed and limit of detection for this biosensor was calculated as 17.2 ppb. Ertekin et. al. (2016) developed a biosensor for detection of AFB1 by using 5 MHz QCM and the limit of detection for this biosensor was found as 1.25 ppb. Within the scope of this study, this value was lowered to 0.25 ppb by use of 120 Mhz Love wave platform and to 0,0002 ppb by conjugation of antibody to PBM 321. Conclusions: As aimed and motivated, 6250 times more sensitive piezoelectric biosensor was developed for detection of small molecules. This study is supported by TUBITAK MRC by the project `Development of Biosensor for Multiplex Toxin Detection (MAMBİYOSENS 5133101).