Kardiyomiyojenik farklılaşma faktörleri, vegf ve deselülarize kalp matriksinin mezenkimal kök hücrelerin farklılaşmasına notch/hedgehog sinyal yolakları üzerinden olan etkilerinin incelenmesi

Abstract

AMAÇ: Sunulan tez çalışmasında sıçan kalbinden deselülarizasyon tekniğiyle elde edilen kalp ekstraselüler matriksinin, kardiyomiyojenik uyarımın ve VEGF molekülünün sıçan kemik iliği kökenli mezenkimal kök hücrelerin farklılaşmasına olan etkilerinin Notch ve Hedgehog sinyal yolaklarındaki değişimler ile incelenmesi amaçlanmıştır.YÖNTEM: Deterjan uygulaması neticesinde kalp dokusundan hücreler uzaklaştırılarak deseleülarize doku ve organları oluşturacak olan mezenkimal kök hücrelerin tutunacağı ve farklılaşma sürecine gireceği kalp ekstraselüler matriksi elde edilmiştir. Deselülarize edilen kalbin ekstraselüler matriksinden hücre ve hücresel kalıntıların tamamen arındırıldığı histokimyasal, immünfloresan ve moleküler olarak kanıtlanmıştır. Sıçan kemik iliği kökenli mezenkimal kök hücreler deselülarize ekstraselüler matriks üzerine ekilmiştir ve matriks üzerinde çoğalmaları sağlanmıştır. Deselülarize ekstraselüler kalp matriksi üzerine ekilen hücreler standart besiyerinde kültüre edilerek, matriks kaynaklı fiziksel uyarım ve bu fiziksel uyarıma ek olarak kardiyomiyojenik farklılaşma eklentilerinin olduğu farklılaşma besiyerinden kaynaklı kimyasal uyarımın kardiyomiyojenik farklılaşma mekanizması üzerindeki etkileri incelenmiştir. Deselülarize yapı iskelesindeki hücrelerin kardiyomiyojenik farklılaşma durumları kardiyomiyosit hücrelerine, Notch ve Hedgehog sinyal yolaklarına özgü belirteçler kullanılarak gen ifadesi düzeyinde Real Time-PCR ile ve protein seviyesinde ise histokimyasal ve immünfloresan boyamalarla tespit edilmiştir.üç boyutlu deselülarize ekstraselüler matriksten elde edilen veriler, standart ve kardiyomiyojenik farklılaşma besiyerinde iki boyutlu olarak kültüre edilen hücrelerle kıyaslanmıştır. Böylece deselülarize kalp matriksi üzerinde yapılan farklılaşma yönteminin verimliliği incelenmiştir.BULGULAR: Elde edilen bulgular kalp deselülarizasyonunun etkili ve başarılı bir şekilde gerçekleştirilebildiğini göstermiştir. Kalp ekstraselüler matriksine ekilen hücrelerin canlılıklarını koruyabildiği ve çoğalmaya devam ettikleri gözlemlenmiştir. Üç boyutlu ekstraselüler matriks üzerinde kardiyomiyojenik farklılaşmaya alınan hücrelerin, iki boyutlu olarak kültüre edilen hücrelere kıyasla daha yüksek seviyede gen ifadesini tetiklediği tespit edilmiştir.SONUÇ: Kalp ekstraselüler matriksinin hücrelerinden tamamen arındırıldığı ortaya koyulmuştur. Deselülarize kalp ekstraselüler matriksinin sıçan kemik iliği kökenli mezenkimal kök hücrelerle reselülarize edilmesi sonrasında, hücrelerin matrikse tutunarak canlıklarını korudukları ve çoğalmaya devam ettikleri gösterilmiştir. Ayrıca deselülarize kalp ekstraselüler matriksinden kaynaklanan fiziksel uyarım ve kardiyomiyojenik farklılaşma eklentilerinden kaynaklanan kimyasal uyarım ile miyokard tabakasına benzer bir yapı elde edildiği gözlemlenmiştir.

OBJECTIVE: In the present thesis study, it was aimed to investigate the effects of heart extracellular matrix obtained by decellularization technique from rat, cardiomiogenic stimulation and VEGF molecule on the differentiation of rat bone marrow derived mesenchymal stem cells with changes in Notch and Hedgehog signaling pathways.METHOD: At the end of the detergent application, the cells were removed from the heart tissue and a decellularized cardiac extracellular matrix was obtained. In this view, three dimensional scaffold was achieved for the mesenchymal stem cells, which will form the tissues and organs, and which will enter the differentiation process. It was proven that the cells and the cell debris were completely removed from the cardiac extracellular matrix as histochemical, immunofluorescent and molecular experiment. Rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells were seeded and provided to proliferate onto decellularized extracellular matrix. Cells reseeded on a decellularized extracellular heart matrix were cultured in a standard medium to investigate the effects of matrix-induced physical stimulation and cultured with cardiomyogenic differentiation supplements containing medium to observe the effect of chemical stimulation for cardiomyogenic differentiation mechanism. Cardiomiogenic differentiation of cells in the decellularized scaffold was determined by cardiomyocyte cells, Notch and Hedgehog signaling pathways specific markers. This finding was gained by real time PCR at the gene expression level and by histochemical and immunofluorescent staining at the protein level. The data obtained from 3-dimensional decellularized extracellular matrix was compared with the cells cultured in 2-dimensional in standard and cardiomiogenic differentiation medium. Thus, the efficiency of the differentiation method on the decellularized heart matrix has been examined.RESULTS: Results obtained from investigations have shown that heart decellularization can be performed effectively and successfully. It has been observed that the cells reseeded onto the heart extracellular matrix can maintain their viability and continue to proliferation of their. Cells undergoing cardiomyogenic differentiation onto a 3-dimensional extracellular matrix were found to induce gene expression at a higher level than cells cultured in 2-dimensional.CONCLUSIONS: It has been shown that cells of the heart were completely removed from the extracellular matrix. It has been shown that after recellularization of the decellularized cardiac extracellular matrix with rat bone marrow derived mesenchymal stem cells, the cells retained their viability and continued to proliferate. It has also been observed that a similar structure to that of the myocardial layer is obtained by chemical stimulation from cardiomyogenic differentiation supplements and physical stimulation from decellularized cardiac extracellular matrix.