Yüksek ve düşük döngülü üremik kemik hastalığı olan kronik böbrek yetersizlikli hastaların serum proteomiks analizi

Abstract

Amaç: Kronik böbrek hastalığında böbrek işlevlerinin gittikçe azalması sonucunda mineral ve kemik metabolizması bozulur. Bu bozukluklara bağlı olarak renal osteodistrofi başlığı altında tanımlanan adinamik kemik hastalığı, osteomalazi, mikst üremik osteodistrofi ve yüksek döngülü kemik hastalığı gelişir. Renal osteodistrofi diyaliz hastalarında veya böbrek nakli sonrası morbiditenin önemli nedenlerinden biridir. Bu nedenle tedavisi veya önlenmesi büyük önem taşımaktadır. Çığır açan bir teknoloji olan proteomiks ise son yıllarda vücut sıvı ve dokularında protein profillerinin belirlenmesinde, hastalıkların mekanizmalarının proteine dayalı araştırılmasında, tanı için yeni bir bio-belirteç keşfinde ve ilaç tedavisi için yeni hedeflerin belirlenmesinde gittikçe önem kazanan güçlü bir yöntemdir. Proteomiks araştırmaları böbrek hastalıklarında giderek artmakta ve ümit verici sonuçlar elde edilmektedir.Bu çalışmada adinamik kemik hastalığı ve yüksek döngülü kemik hastalığı olduğu düşünülen hastaların serumlarında farklı protein ekspresyonlarının var olup olmadığının incelenmesi ve bunların hastalık patogenezine katkısı olup olmadığının araştırılması amaçlanmıştır.Metod: Diyaliz seansı öncesi PTH <100 pg/ml (C) ve >1000 mg/dl (H) olan hastalardan alınan serumlar 2D jel elektroforezinde yürütüldü. Coomasie mavisi ve Sypro Rubby ile boyanıp ortaya çıkarılan protein spotları VersaDoc görüntüleme cihazı ile görüntülendi. PDQuest advanced yazılımı ile analiz edildi. Genellikle hastaların çoğunluğunda bir fark belirlenemez iken paratiroidektomi yapılan H6 kodlu hastada paratiroidektomi öncesi ve sonrası alınan serum örneklerinden yürütülen jellerde anlamlı farklılıklar gözlendi ve bu farklı olduğu düşünülen spotlar kesilerek EXQuest cihazı ile MALDI-TOF analizi için gönderildi.Bulgular: H ve C olarak gruplandırılan hastalarda 51 farklı protein spotu tespit edilmesine rağmen bunlar gruplar arasında benzer dağılım göstermemekteydi. Miktarı fazla olan proteinlerin indirgenmesinin yeteri kadar başarılı olmaması spot analizini güçleştirdiği görüldü. SyproRubby boyası belirlenen spotlardan daha farklı spot tespitini sağlamadı. Spot profilindeki en belirgin farklılık H6'nın serumundan yürütülen jellerde görüldü ve jel üzerinde 5 farklı bölgede 25 farklı spot belirlendi.Sonuç ve tartışma: Serum, çok yoğun protein içerdiği ve albumin indirgenmesi güçlüğü nedeni ile proteomiks analizinin yorumlanması problem yaratabilir. Ancak kolay elde edilebilmesi ve tüm dokularla teması olması, fizyolojik ve patolojik koşullarda meydana gelen protein profilindeki değişiklikleri iyi yansıtması nedeniyle önemli bir kaynaktır. Analizinde miktarı fazla olan proteinlerin indirgenmesi en önemli adımdır. Bu proteinlerin indirgenme işlemi sırasında, belirteç adayı olabilecek miktarı az olan proteinlerin de uzaklaştırılmasına neden olabileceği akılda tutulmalıdır. Mevcut imkanlarla bu proteinlerin indirgenmesi henüz yeteri kadar sağlanamamaktadır. Literatürde üremik kemik hastalarının serumlarında yapılmış proteomiks çalışması yoktur. Ancak hayvan modelleriyle yapılan çalışmalarda eksojen PTH'un serum ve kemik iliği hücrelerinin protein profilini değiştirdiği tespit edilmiştir. Bu proteinler kemik döngüsünün düzenlenmesinde rol alabileceği gibi kemik yeniden şekillenmesi sırasında kemikten salınan proteinler olabilir. Bu bilgiler ışığında istatiksek olarak anlamlı olmasa da H ve C grubundan elde edilen spot farklılığı PTH düzeyine yanıt olabilir. Ayrıca H6'nın ameliyat öncesi ve sonrası serum PTH düzeyi dikkate alındığında her iki durumda yürütülen jellerden elde edilen spot farklılıklarının PTH'a yanıt olarak salınan proteinlere ait olabileceği yorumu yapılabilir. Bu varsayım ispatlanabilir ise adinamik kemik hastalığı patogenezi ile ilgili bir protein belirtecinin varlığının gösterilmiş olabileceği düşünülmektedir.Anahtar Kelimeler: Proteomiks, Renal Osteodistrofi, Üremik Kemik Hastalığı, adinamik kemik hastalığı

In kidney diseases, due to a gradual loss of kidney function, the metabolisms of mineral and bone are disrupted. As a result of these disturbances, a group of bone diseases, named as renal osteodystrophy and includes adynamic bone disease, osteomalasia, mixed uremic bone disease and high turnover bone disease emerges. Renal osteodystrophy is a significant reason for morbidity in dialysis patients and renal transplantation. The treatment of renal osteodystrophy is therefore very important. A breakthrough technology which allows scientists to visualize and perform comparative analysis on protein profiles of biological fluids and discover new biomarkers for early detection of diseases and understand the effects of drugs on treatment is rapidly emerging. Proteomics research is taking part in renal diseases and promising results are being obtained.In this study, the protein profiles of patients who had adynamic or high turnover bone diseases were elucidated by using serum as the biological material and a relationship was tried to be established between the pathologic state of the diseases and the protein profiles with an hope of discovering a new protein marker.Methods: 2D gel electrophoresis was performed on pretreated serum samples which were obtained before dialysis of the patients with a PTH values of <100 pg/ml and >1000 mg/dl. The 2D gels were stained with Coomassie blue or SyproRuby and images were taken with VersaDoc imager. The images were analyzed with an image analysis software, PDQuest. In general, we did not detected any significant differences in protein profiles of patients and controls except that the protein profile of the the patient H6 displayed spot that could not be detected in others. We were also able to analyze the protein profile of this patient after paratiroidectomy. Spots that were different were cut with ExQuest and analyzed with MALDI TOF-TOF.Results: Although we found 51 different spots in between groups formed by H and C, the distributions were not uniform. We faced a difficulty of eliminating high abundance proteins from samples due to the nonspecific binding to Blue G column. The results of analysis were independent of staining procedure and using Coomassie stain or Sypro ruby did not make a difference. The analysis of H6 sample revealed 25 unique spots grouped in 5 different regions in gels and this was repeatable.Discussion: Serum is a difficult sample to work with because of the presence of high abundant proteins that blocks the low abundant proteins in 2D gels. However, because of the ease of reaching serum and because serum may represent the protein profile of disease states of the body, serum is an important material to work with. The first step in analysis of serum samples is to reduction of the high abundance proteins, such as albumin, haptoglobulin, ferritin and etc. A difficulty that researchers face with during reduction is the loss of low abundance proteins. With the present opportunities in our lab, we were not able to escape from these difficulties. Besides, to our knowledge there is no proteomics study performed with serum samples of uremic bone disease. The studies that we found used animal models and administered exogenous PTH and studied the effect on serum protein profiles. The protein spots that were determined play roles in bone turnover and bone remodeling. Although statistically not significant, the different spot that was observed might be a response to the PTH levels. This finding can be supported by the finding that spot profiles of a patient before and after parathyroid surgery differed significantly. If this can be strengthen further, a marker protein or a group of proteins can be used to predict the state adynamic bone disease.Keywords: Proteomics, Renal Osteodystrophy, Uremic Bone Disease, Adynamic Bone Disease