Mikrobakteri türlerinin moleküler metotla belirlenmesi

Abstract

ÖZET Isı şok proteinleri, ısıdaki ani artış veya diğer çevresel strese karşı cevapta sentezlenen proteinlerdir. Bilinen tüm mikobakteri türlerinde olan 65 kDa ısı şok protein'in hsp65 genindeki dizilim farkları hem yavaş hem de hızlı üreyen mikobakteri türlerinin saptanmasında kullanılabilmektedir. hsp65 genin Polimeraz Zincir Reaksiyonu - Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) analizi metodu bütün mikobakteriler için ortak olan primerler kullanılarak elde edilen PCR ürününün restriksiyon enzim analizine dayanır. Bu metot sıvı besiyerinde üreyen kültürlere uygulanabilmekte ve bir günde sonuçlanmaktadır, mikobakterileri tür düzeyinde identifiye etmek için standart bir yöntemdir, hibridizasyon, radyoaktivite gerektirmez. Bu araştırmada Kord faktör ve NAP testi ile Mycobacterium tuberculosis kompleks (MTK) ve Mycobacteria Other Than Tuberculosis (MOTT) tanısı konmuş mikobakterilerin PCR-RFLP analizi metodu kullanılarak doğrulanması ve aynı zamanda MOTT olarak kabul edilen türlerin identifikasyonu amaçlanmıştır. NAP testiyle 3-5 günde sonuç alınırken, bu metotla 1 günde sonuç alınabilmiştir. Kord faktör ve NAP testi ile MTK olarak isimlendirilen 10 köken PCR-RFLP metoduyla'da MTK olarak kabul edildi. MOTT olarak kabul edilen 14 köken ise kullandığımız moleküler metotla PCR ürününün kesilmesi ile ortaya çıkan bantların değerlendirilmesiyle Mycobacterium türleri olarak identifiye edildi. Bunlar: 3 köken M. intracellulars tip I, 2 köken M.phlei, 2 köken M.kansasii ve Yer köken de M.fortuitum tip I, M.gordonae tip I, M.abscessus tip I, M.scrofulaceum, M.szulgai tip I, M.avium tip II, M.terrae olarak bulundu. 47PCR-RFLP; çok hızlı (24 saat), mikobakterilerin tür düzeyinde tam identifikasyonunu yapabildiğinden rutinde kullanılacak bir metot olarak kabul edilebilir. Anahtar kelimeler: Mycobacteria, PCR-RFLP, hsp65. 48

IDENTIFICATION OF MYCOBACTERIA SPECIES BY MOLECULAR METHODS SUMMARY Heat shock proteins are the ones synthesized in response to sudden increase in temperature or other enviromental stress factors. All the known mycobacteria have 65kDa heat shock protein. Sequence differences of hsp65 gene can be used to identify both rapidly or slowly growing mycobacteria. Polimeraz Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR- RFLP) analysis of the hsp65 gene method involves restriction enzyme analysis of PCR products obtained with primers common to all mycobacteria. This method is a standart procedure which can identify mycobacteria to the species level, can be performed within one working day, doesn't include hybridization steps or radioactivity but can be performed only with fluid culture media. In this study, mycobacteria identified as M. tuberculosis complex (MTC) and Mycobacteria Other Than Tuberculosis (MOTT) before with cord factor and NAP test were reidentified with PCR-RFLP analysis method. MOTT were also identified to the species level. Although the NAP test resulted within 3-5 days, PCR-RFLP resulted in one day. Ten species identified as MTC with NAP and cord factor were confirmed with PCR-RFLP. With the restriction of PCR product with PCR-RFLP, fourteen species identified as MOTT were also identified to the species level. These are as follows: Three species M.intracellulare type I, two species M.phlei, two species M.kansasii and one species M.fortuitum tip I, one species M.gordonae type I, one species 49M.abscessus type I, one species M.scrofulaceum, one species M.szulgai type I, one species M. avium type, one species M.terrae.W. PCR-RFLP is a very rapid method which provides exact identification of mycobacteria species so it can be performed in routine procedures. Keywords: Mycobacteria, PCR-RFLP, hsp65. 50