Normal ve translokasyon taşıyıcısı erkeklerin spermiumlarında FISH ile kromozom analizi

Abstract

ÖZET insan gametlerindeki kromozom anomalilerinin sıklığı uzun zamandan beri merak edilen ve üzerinde çalışmaların yapıldığı konulardan birisidir. Ancak insan oositlerinin elde edilmesindeki zorluk ve spermium kromozomlarının yalnızca fertilizasyondan sonra görünür hale gelmesi insan gametlerinin kromozomal yapısının direkt olarak incelenmesini oldukça zorlaştırmaktadır. Spermiumların, oositlere göre elde edilme açısından daha uygun olması, insan sperminde en doğru bilgi veren yöntem arayışına gidilmesini sağlamış ve bu amaçla çeşitli yöntemler denenmiştir. İlk olarak quinacrine ile interfaz spermiumunda Y-cisimciği incelemesine başlanmış, bunu sperm-hamster oosit penetrasyon yöntemi sonrası kromozom analizi takip etmiş ve günümüzde de spermium nukleuslarında FISH analizi tekniklerinin uygulanmasına kadar gelmiştir. Bu çalışmada normal ve translokasyon taşıyıcısı 20 erkek olguda ejekülat örneklerinden yıkama sonrası hazırlanan spermium preparatlarında FISH analizi gerçekleştirilmiştir. Araştırmada normal erkeklerin (10 birey) örneklerinde X ve Y kromozomlarına ilişkin lokus spesifik problar kullanılarak hibridizasyon etkinliği, yöntemin güvenilirliği, gametik seks kromozom dağılımı ve dizomi sıklığının belirlenmesi amaçlanmıştır. Translokasyon taşıyıcısı (10 olgu) erkeklerin örneklerinde ise ilgili translokasyon segmentlerine uygun lokus spesifik problar ve/veya tüm kromozom problarının kullanılmasıyla germ hücrelerindeki segregasyon dağılımının değerlendirilmesi ve yöntemin kullanılabilirliğinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Normal 10 olguya ilişkin analizlerde hibridizasyon etkinliği %92.53 olarak saptanmış ve yöntemin güvenilirliği ortaya konmuştur. Gametik seks kromozom oranı X:Y=1.024 olarak belirlenmiştir. Dizomi sıklığ X kromozomu için %0.18, Y kromozomu için %0.17 olarak saptanmıştır. Translokasyon taşıyıcısı 10 olguda 11 translokasyon (bir olgu çifte translokasyon taşıyıcısı) incelenmiştir. Bir olguda azospermi nedeniyle analiz yapılamamış, iki olgu translokasyon segmentleri üzerindeki kırık noktalarına spesifik problarla, kalan yedi olgu tüm kromozom problarıyla incelenerek segregasyon oranları ortaya konmuştur. Lokus spesifik probların kullanıldığı iki olguya ilişkin ortalama segregasyon oranları; %69.42 karşılıklı ve komşu-1 segregasyonu, %30.51 komşu-2 segregasyonu %78.70 karşılıklı ve komşu-2 segregasyonu, %21.28 komşu-1 segregasyonu olarak bulunmuştur. Tüm kromozom problarının kullanıldığı yedi olgu ve sekiz translokasyona ilişkin ortalama segregasyon oranları; %64.37 karşılıklı segregasyon, %23.04 komşu-1 segregasyon, %11.66 komşu-2 segregasyon, %1.06 oranında 3:1segregasyon olarak saptanmıştır. Yapılan çalışmada incelenen farklı translokasyonlardaki segregasyon tiplerinin ortalama dağılımları incelendiğinde en sık karşılıklı segregasyon gözlenmiş, bunu sırasıyla komşu-1 segregasyonu, komşu-2 segregasyonu ve 3:1 segregasyon izlemiştir. Yöntemin özellikle anöpioidi tayininde ya da belirli bir kromozoma yönelik, belirli bir anomalinin taranmasında, kısa sürede büyük sayılardaki örneklerin incelenmesinde kullanılabileceği ortaya konmuştur. Ancak yöntemin henüz kısıtlı sayıda olguda çalışılmış olması nedeniyle özellikle translokasyon taşıyıcısı erkeklerin araştırılmasında güvenle kullanılabilmesi için büyük donör serilerinde analizlerin gerçekleştirilmesi ve sonuçların karşılaştırılması gerekmektedir. Anahtar Kelimeler: Sperm, FISH, Anöpioidi, Translokasyon Taşıyıcısı, Gametogenez, Kromozom Segregasyonu.

SUMMARY One of the subjects in medical genetics is the frequency of chromosome abnormalities in human garnets and has been investigated intensively. However, the difficulty of obtaining human oocytes and the occurance of spermatazoa chromosomes only after fertilization have been inhibited the direct analysis of chromosomal constitution of garnets. Since obtaining of human sperms is easier than of oocytes, various methods have been tried to find the most informative and sensitive one(s) in analysis of human spermatazoa chromosomes. These methods have started with the examination of the `Y-body° in spermium with quinacrine, have continued with direct chromosome analysis of sperms through sperm-hamster oosit penetration technique, and today FISH analysis is becoming a routinely used method in sperms. In this study, FISH analysis has been carried out in the spermatazoa of 10 normal and 10 translocation carriers, totally 20 males, by using both locus spesific and painting DNA probes. By the usage of X and Y chromosome locus specific probes in sperms of 10 normal males, the determination of hybridization sensitivity, the method efficiency, sex chromosome segregation and disomy frequency were aimed. In the semen samples of 10 translocation carrier males, the locus specific and/or whole chromosome painting probes, spesific to translocated segments were used for the evaluation of translocated segments, the evaluation of gametic segregation frequencies, and determination of the reliability of FISH technique, especially in the samples from the males with chromosome abnormalities. In the analysis of normal 10 cases, hybridization efficiency has been found as 92.53% which is the stigmata of the reliability of the method. The ratio of gametic sex was X:Y=1.024. Disomy frequency was 0.18% for the X chromosome; and 0.17% for the Y chromosome. Eleven translocations have been examined on 10 translocation carriers (one case with double translocation carrier). Analysis could not be performed in a case with azospermy whereas locus specific probes, whose localizations were in the breakpoints of the translocated segments were used in 2 cases, and the chromosome painting probes were used in the remaining 7 cases. The mean segregation ratie in samples of 2 cases in which locus spesific probes used were 69.47% for alternate and/or adjacent-1, 30.51 %for adjacent-2, 78.70% for alternate and/or adjacent-2, 21.28% for adjacent-1 segregation types. The ratio for the 7 cases and 8 translocations were determined as follows: 64.37% alternate; 23.04% for adjacent-1, 11.66% adjacent-2 and 1.06% 3:1 segregation. In conclusion, although the mean segregation ratio of the involved chromosomes are changing according to the different translocations, the mostly seen segregation type is alternate which is followed by adjacent-1, and adjacent-2. These are in agreement with the order of expected segregation types. On the otherhand, the FISH analysis in sperm samples is a relatively reliable and sensitive technique in respect to aneuploidy and/or a given chromosome abnormality detection, and the analysis of large number of cells in a short time, VIas well. However, further studies with large donor series are necessary for determination of the reliability of that technique. Key Words: Sperm, FISH, Aneuploidy, Translocation Carrier, Gametogenesis, Chromosome Segregation. VII