Sistemik, otokrin ve parakrin etkili ß-endorfin ve oosit/embiryo ileri gelişim medyumlarının sıçan pre-antral follikülerinin in vitro gelişimi üzerindeki etkileri

Abstract

ÖZET Günümüzde oosit in vitro matürasyonunu (TVM) düzenleyen faktörlerin mekanizmasının moleküler ve biyokimyasal yönü hakkındaki bilgiler, hala parçalar şeklindedir. İn vivo ve in vitro mature edilmiş oositlerin gelişimsel kapasiteleri arasında büyük farklılıklar vardır. Bu farklılığın nedenlerinden biri, mitozla bölünen somatik hücreler için kullanılan kültür medyumlarının, mayozla bölünen oosit için yetersiz kalması olabilir. Endojen opioid bir peptid (EOP) olan P-endorfin ise, merkezi düzeyde olduğu gibi periferal dokularda lokal olarak sentezlenir ve buradaki fizyolojinin düzenlenmesinde parakrin ve/veya otokrin role sahiptir, p-endorfinin, reprodüktif sistemin çeşitli bölgelerinde bulunduğu belgelenmiştir. Ovaryumda P-endorfin folliküler gelişimin, gonadotropin aktivitesinin, steroid sentezinin düzenlenmesinde ve sıçan oositlerinin mayoza kaldığı yerden devam etmesinde yer alır (32, 176). Bu nedenle çalışmamızda, mayozun in vitro ortamdaki ihtiyacım karşılayabilmek için; oosit ve embriyo ileri gelişim medyumları kullanılarak geliştirdiğimiz kültür sisteminin geçerliliği ve P-endorfinin follikül gelişimi ve gelişen folliküllerin ürünleri olan M-II oositlerin gelişim kapasitesi üzerindeki etkisini ortaya koymayı amaçladık. Sprague Dawley sıçanlardan sınırlandırılmış enzimatik sindirim tekniğiyle elde edilen <120 um çapındaki erken ve orta sekonder folliküller, kültürün O.gününden, Graaf follikül aşamasına (12.güne) ve ovulasyona (14.güne) kadar kültür edildi Tüm gruplarda medyuma 2 mM hypoxanthine, 5 ug/ml insülin, 5 ug/ml iron-saturated- transferin, 5 ng/ml selenium (ITS), 4 ug/100 ml hydrocortizone ve 100 IU/ml FSH eklendi. 12.günde ovulasyon 2.5 IU/ml HCG ile indüklendi. Deney gruplarmda ise follikül kültür medyumuna p-endorfînin farkh dozları (10, 100, 1000 ng/ml medyum) eklendi. IVM/IVG (in vitro mature/growth) edilmiş oositlerin IVF'u (in vitro fertilizasyonu) ve fertilize oositlerin embriyo kültürü (3 gün süreyle) gerçekleştirildi. Inverted mikroskopta kültürdeki follikül, oosit ve embriyoların morfolojisi ve kültürün 0, 2, 4, 6, 10 ve 12.gününde follikül ve 14.gününde oosit çaplan izlendi Follikül, oosit ve embriyoların histolojik incelemesi, 2, 4, 6, 10, 12 ve 14. rVM günlerinde ve IVF'un 3. gününde ışık ve elektron mikroskobu ile yapıldı. Parafinkesitler H&E, yarı-ince kesitler toluidin mavisi ve ince kesitler ise %2'lik uranyl acetate ve %4'lük kurşun sürat ile boyandı. Geliştirdiğimiz kültür sistemiyle pre-antral folliküllerin 12 günlük kültüründe, tüm gruplarda; % 15-22 oranında Graaf follikül, bu folliküllerin in vitro ovulasyomıyla % 56-72 oranında matür (M-II) oosit, bu oositlerin IVF'u ile % 53-70 oranında fertilize oosit ve bu embriyoların in vitro kültürü ile % 57-78 oranında 4-9 blastomerli embriyo elde edildi. Graaf follikülleri açısından kontrol ve 10, 100, 1000 ng/ml p-endorfin gruplarında sırasıyla % 18, % 18, % 15, % 22; M-II oosit eldesi açısından kontrol ve 10, 100, 1000 ng/ml P-endorfin gruplarında sırasıyla % 62, % 67, % 56, % 72 olarak bulunan değerlerden, 1000 ng/ml P-endorfin grubunda daha yüksek olan erken ya da orta sekonder folliküllerden Graaf follikül gelişimi ve Graaf follikülden M-II oosit elde edilmesi oranlarında istatistiksel olarak çok anlamlı (p<0.01**) ve anlamlı (p<0.05*) düzeyde fark olduğu saptandı. înseminasyon için kullanılan M-II aşamasındaki oositlerin ortalama çapı bakımından incelendiğinde, 100 ng/ml p-endorfin uygulanmış grupta diğer gruplara göre ortalama çap istatistiksel olarak ileri derece anlamlı (pO.001***) düzeyde yüksek bulundu. Tüm gruplardan elde edilen oosit çaplarının fertilizasyon ve embriyo oranına etkisi incelendiğinde ise kontrol grubunda yalnızca oosit çapı ile embriyo oluşumu arasında anlamlı fark (p<0.05*) varken p-endorfînin 10, 100, 1000 ng/ml' lik gruplannda oosit çapı ile hem fertilizasyon oram hem de embriyo oluşum oram arasında çoğunlukla ileri düzeyde fark (sırasıyla pO.001***, p<0.001***, p<0.05*, pO.001***, pO.001***, p<0.001***) vardı. Inverted, ışık ve elektron mikroskop ile yapılan incelemelerde, kontrol ve deney grupları arasında morfolojik düzeyde belirgin fark gözlenmedi. Kullandığımız kültür sistemiyle elde edilen oranlar, oldukça çeşitli oranlara sahip geleneksel kültür sistemleriyle karşüaştırüdığında genelde başarılı kültür sistemleri arasında yer aldı. 1000 ng/ml'lik p-endorfin dozunun, in vitro Graaf follikül ve matür oosit eldesi oranlarında; 100 ng/ml'lik dozunun M-II oosit çapmda ve 10, 100 ve 1000 ng/ml'lik dozların ise oosit çapı ile fertilizasyon ve embriyo gelişimi arasındaki ilişki üzerinde istatistiksel olarak anlamlı etkileri gözlendi Bu sonuçlarımız, in vivo follikülogenezisde P-endorfinin etkilerini ortaya koyan sonuçları desteklerken, in vitro olarak da bu gereksinimin karşılanması gerektiğini göstermektedir (122). iiOosit ve embriyo için pratikte oldukça verimli bir şekilde kullanılan IVF medyumlarının, follikül kültüründe kullanılması ve kültür ortamım daha olumlu etkileyebilecek P-endorfin gibi in vivo faktörler ile zenginleştirilmesi ve böylece oosit/folliküllerin in vitro ortamdaki ihtiyaçlarının karşılanması gerektiğini ortaya koymuştur. iii

SUMMARY Nowadays, the molecular and biochemical knowledge of the mechanism of factors regulating in vitro oocyte maturation is still fragmentary and large differences still exist in the developmental competence between in vivo and in vitro matured oocytes. One of these differences is that culture media of the somatic cells mitotic matured may be insufficient for oocyte meiotic maturation, p-endorphine, endogen opioid peptide (EOP), has paracrin and/or autocrine roles in regulating physiology of periferic tissues as well as central level It was documented that p-endorphine is located in several regions of reproducctive system. In ovaries, P-endorphine involves in the control of folliculer development, regulating gonadotropin activity and steroid synthesis, and resumption of rat oocyte meiosis. In our study, we aimed to investigate the validity of our new culture system using advanced development medium for oocyte and embriyo to meet the need of meiosis in vitro, and to reveal the effects of P-endorphine on folliculer development and on developmental competence of M-II oocytes resulting from folliculer development. Early and medium secondary follicles with a diameter of < 120 mm that were isolated from Sprague-Dawley rats by limited enzymatically technique have been cultured for up to Graaf follicle step (the day 12) and up to ovulation step (the day 14). In all groups, 2 mM hypoxanthine, 5 mg/ml insulin, 5 mg/ml iron-saturated-transferrin, 5 mg/ml selenium (ITS), 4 mg/100 ml hydrcortizone and 100 IU/ml FSH were added to the culture medium. On day 12, ovulation was induced by 2.5 IU/ml of HCG. B- endorphine was added at the dose of 10, 100, 1000 ng/ml to the culture medium of three experimental groups. In vitro grown and matured oocytes were in vitro fertilized, and the fertilized oocytes were also cultured for embriyo culture for a further 3 days. A histological analysis of follicles, oocytes and embriyo s was carried out on paraffin, semi-thin and thin sections on day 2, 4, 6, 10, 12 and 14 of in vitro follicle culture and on day 3 of embriyo culture with usin light and electron microscope. Paraffin sections were stained with H&E, semi-thin sections with Tohiidine Blue, and thin sections with 2% Uranyl acetate and 4% lead citrate. After 12 days of culture, considering the results of four study groups, 15- 22% of preantral follicles matured in vitro became Graaf follicles. 56-72% of Graaf IVfollicles with in vitro ovulation reached the matured (M-II) oocytes, whereas 53-70% of M-n oocytes fertilized after in vitro fertilization. 57-78% of these fertilized oocytes became 4-9 blastomers embriyo. Graaf follicle formation rates in control group, 10 ng/ml, 100 ng/ml and 1000 ng/ml P-endorphine groups were 18%, 18%, 15% and 22%, respectively. Graaf follicle formation rate in the group with 1000 ng/ml P-endorphine was higher than those of other groups (p<0.01). M-II oocyte fertilization rates in control group, 10 ng/ml, 100 ng/ml and 1000 ng/ml P-endorphine groups were 62%, 67%, 56% and 72%, respectively. M-II oocyte formation rate in the group with 1000 ng/ml B- endorphine was higher than those of other groups (p<0.05). Mean diameter of M-II oocytes used for insemination in the group with 100 ng/ml p-endorpine was higher than those of other groups (p<0.001). There was no morphological differences between control and experimental groups in the light, inverted and electron microscopic examinations. Comparing our follicle survival rates obtained in new culture system with those of conventional culture system, our culture system has been found to be successful. The effect of the dose of 1000 ng/ml p-endorphine on Graaf follicle and M- II oocyte formation, and the effect of the dose of 100 ng/ml P-endorphine on the mean diameter of M-II oocytes was statistically significant. There was also positive correlations between the diameter of oocyte and fertilization rate and embriyo development in the groups with p-endorphine. Our findings supported the results of the studies reveal the effect of P- endorphine in in vivo folliculogenesis, and also revealed this need should be met.