Deneysel hipertiroidi oluşturulmuş gebe sıçanların uterus ve plasenta dokularında osteonektin (SPARC) ve TGFβ-1 dağılımının immünohistokimyasal olarak incelenmesi

Abstract

Hipertiroid tiroid hormonları serum seviyesinin yükselmesiyle tanımlanır. Üreme sistemi de dahil olmak üzere birçok dokuda çeşitli komplikasyonlara sebep olmaktadır. Üreme sistemiyle ilgili implantasyon başarısıslığı, abortus, plasenta dekolmanı, pre-eklempsiye gibi hipertiroidin etkileri değişmektedir. Çalışmamızda yer alan SPARC protein ekstraselüler matrkisin ve hücre-matriks iletişimini şekillendiren matriselüler bir proteindir. Hipertiroididen etkilendiği bilinen Vasküler endotelyal büyüme faktörüne (VEGF) direk bağlandığı ve Dönüştürücü büyüme faktörü β-1 (TGFβ-1) ile etkileşim halinde SPARC'ın fonksiyonel olduğu bilinmektedir.Çalışmamızda farklı döenem gebelikte hipertiroidinin sebep olduğu komplikasyonların hücresel düzeyde sebeplerinin aydınlatılmasına katkıda bulunmayı hedefledik. 24 adet dişi Sprague Dawley sıçan 6 üyeli halinde 4 gruba ayrıldı ( kontrol 5. grup, kontrol 20. grup, hipertiroid 5. grup, hipertiroid 20. grup). Hipertiroid grubuna 21 gün boyunca L-tiroksin subkutan olarak uygulandı ve uygun erkek sıçanlarla bir araya bırakılarak gebelik gelişmesi sağlandı. Vajinal smear ile gebelik tayini yapılan hayvanlar gebeliğin 5. ve 20. günlerinde sakrifiye edilerek plasenta ve uterus dokuları alındı. Uterus endometrium ve bez epitel hücrelerinde 100 hücrede pozitif hücre sayısı elde edilerek, plasenta bazal plak tabakasında mm2'de pozitif hücre sayısı sayılarak, labirent katmanında ise mm2'de semikantitatif değerlendirme ile SPARC, VEGF and TGFβ-1 immünoreaktivitesi analiz edildi. Protein seviyesinde SPARC ve VEGF ekspresyonunu anlamak için 5. gün ve 20. gün uterus dokuları ve plasenta dokusu Western Blot ile incelendi. Semikantitatif değerlendirme şu şekilde skorlandı; 0=reaksiyon yok; 1=zayıf reaksiyon, hücre reaktivitesi 25%'in altındaysa, 2=orta reaksiyon, %25-50 arasındays; 3=kuvvetli reaksiyon, 50-75 arasındaysa ve 4=çok kuvvetli reaksiyon %75'den fazlaysa.Bulgu olarak, 5. gün hipertiroid endometrium ve bez epitel hücrelerinde, control grubuna göre SPARC ekspresyonunun anlamlı değişme göstermediği; VEGF ve TGFβ-1 'in ise azaldığı gözlenmiştir. 20. gün endometrium ve bez epitellerinde ise, hipertiroid grubunda SPARC ekspresyonunun azaldığı, VEGF ve TGFβ-1 ekspresyonunun arttığı gözlenmiştir. Plasenta bazal tabakada ise SPARC iki grup arasında değişiklik göstermezken, VEGF ve TGFβ-1 kontrol grubuna göre hipertiroid grubunda artma göstermiştir. Labirent katmanında ise SPARC ve VEGF semikantitatif analizle kontrol grubuna göre daha yüksek skor alırken, TGFβ-1 daha düşük skor vermiştir. Western Blot bulgularında ise 5. gün, 20. gün uterus dokularında ve plasenta dokusunda SPARC azalma gösterirken, VEGF ekspresyonu 5. gün uterus dokusunda ve plasenta dokusunda artmış, 20. gün uterus dokusunda azalma göstermiştir. Bulgular istatistiksel olarak analiz edilmiştir.Sonuç olarak hipertiroid ile birlikte uterus ve plasenta SPARC, VEGF ve TGFβ-1 ekspresyonları değişmektedir. Hipertiroid VEGF and TGFβ-1 ekspresyonlarını erken dönem gebelikte azalmasına sebep olurken SPARC'ta anlamlı bir değişikliğe sebep olmaması erken dönem desidualizasyon sürecinde SPARC'la aynı işlevde olan diğer matriselüler proteinlerin varlığını düşündürmektedir. Geç dönem gebelikte ise SPARC'ın büyüme faktörleri ile etkileşimi halinde olduğu düşünülmektedir. SPARC'ın diğer büyüme faktörleri ile etkileşiminin mekanizmasını anlamak için daha ileri araştırmalara ihtiyaç vardırç Bu iletişimi ortaya çıkarmak hipertiroidden kaynaklanan gebelik komplikasyonlarının tedavisinde yeni bir kapı aralayabilir.

Hyperthyroidism is defined with high blood levels of thyroid hormones. As for reproductive system, hyperthyroidism causes various complications such as miscarriage and pre-eclempsia. In addition, SPARC is a matricellular protein to regulate the organization of extracellular matrices and cell-matrix interactions. It binds directly to Vascular endothelial growth factor (VEGF) and also interacts with Transforming Growth Factor β-1(TGF β-1) which the expression levels also change in hyperthyroidism, in addition to various growth factors .In our study, we aim to contribute to the underlying mechanism of the complications because of hyperthyroid during pregnancy in different stages. Twenty four female rats are divided into four groups (control 5thday, control 20thday, hyperthyroid 5thday and hyperthyroid 20thday; n=6 for each). L-thyroxine are administered to animals for 21 days to establish hyperthyroid and then mate with male rats to develope pregnancy. With vaginal smear analysis, the pregnancy are identified. In the 5thday and 20thday of pregnancy, the animals are sacrified; the immunoreactivity of SPARC, TGFβ-1 and VEGF protein expression are analysed in placenta and uterine tissues. The protein expression level of SPARC and VEGF are detected by Western Blot in palcenta and uterine tissue. 20thday placenta sections are analysed by counting the number of positive cells per mm2 whereas 5thand 20thday uterine sections are graded with semiquantitative scoring system as described. The intensity of staining with antibodies are subjectively scored; 0=nonreactivity; 1=weak, individualized cell reactivity in ≤25% of magnified area; 2=mild to moderate reactivity in ≤50% of magnified area; 3=strong reactivity in ≤75% of islets; and 4=very strong reactivity in >75% of magnified area.As a result, we observed that in hyperthyroid endometrium epithelial and glandular epithelial cells, the expression of SPARC does not change in comparison to control group whereas that of VEGF and TGFβ-1 decrease in 5th day. In 20th day uterine endometrium and glandular epithelial cells, the expression of SPARC decreases whereas that of VEGF and TGFβ-1 increase. In placenta basal plate of hyperthyroid groups, expression of SPARC has no change, however immunoreactivity of VEGF and TGFβ-1 increases comparing to control groups. In the placenta labyrinth zone, SPARC and VEGF show higher score; TGFβ-1 shows lower score in comparison to control group with semiquantitative analysis. As for Western Analysis, in placenta and uterine tissues of hyperthyroid groups, SPARC band intensity decreased when they were compared to control groups. VEGF expression in 5th day uterine and placenta in hyperthyroid group increased wheras it decrased in hyperthyroid 20th day uterine. The results were statistically evaluated.In conclusion, SPARC, VEGF and TGFβ-1 are underlying proteins of the complications of hyperthyroid in uterine and placenta tissues during pregnancy. Hyperthyroid affect VEGF and TGFβ-1 expression in uterine during pregnancy in the same profile when it accounts for only endometrium. The results show that SPARC has not active role in the early pregnancy. It could be the activity of other matricellular proteins which share the similar function with SPARC. However in 20th day uterine, hyperthyroid changes SPARC expression. In the early preganancy, it shows that SPARC does not have correlation with VEGF and TGFβ-1. Uderstanding the intearaction between SPARC and growth factors, further studies are required. Understanding the interactions between them and the downstream and upstream mechanisms contributes the treatments to prevent fertility dysfunctions because of hyperthyroidism.