Viral vektör aracılıklı gen aktarımı yöntemi ı̇le farelerin kortikal nöronlarının görüntülenmesi

Abstract

Viral Vektör Aracılıklı Gen Aktarımı Yöntemi İle Farelerin Kortikal Nöronlarının GörüntülenmesiGiriş ve Amaç:Son yıllarda merkezi sinir sistemindeki hücrelere genetik madde aktarımında viral vektörlerin kullanımı oldukça sık tercih edilmektedir. Adeno- assosiye virüsler (AAV) hem bölünen hem de bölünmeyen hücrelerde verimli bir transdüksiyon sağladığından ve immünojenitesi düşük olduğundan, özellikle nöral hücrelere gen aktarımında ideal bir seçimdir. Bu tez çalışmasında, AAV9 serotipi kullanılarak, farelerin beynindeki spesifik hücre topluluklarından biri olan kortikal motor nöronlara yeşil floresan protein (GFP)'ini kodlayan genin farklı yöntemler aracılığıyla aktarımının yapılması ve sonuçlarının karşılaştırılması amaçlanmıştır.Yöntem ve Gereç:Gen aktarımında kullanılacak plazmid tabanlı rekombinant viral vektörün tasarımında tek zincirli AAV genomu kullanıldı. İki tekrarlayan dizi (ITR) bölgesinin arasına, Sitomegalo virüs (CMV) promotoru, güçlendirilmiş yeşil floresan geni (EGFP), Woodchuck hepatitis post-transkripsiyonel düzenleyici elementi (WPRE), beta-globin intronu ve bovin büyüme hormonu poli(A)'sı yerleştirildi. E. coli bakterisine transforme edilen plazmidler çoğaltıldıktan sonra iki ITR uçlarından kesilip virüs kapsidi içine paketlendi. Paketlenen viral vektörler, C57BL/6 cinsi farelere(her yöntem için 5 adet olacak şekilde, toplam 10 adet), postnatal 45. günde, intraparankimal ve sistemik olmak üzere iki farklı yolla enjekte edildi. İntraparankimal yöntemde stereotaksi cihazı yardımıyla, Bregma referans noktasına göre +1.42 mm ön-arka ve +1.5 mm medio-lateral koordinatlar kullanılarak, motor korteks bölgesine erişim hedeflendi. Viral genom titeri 1012 olan vektörler her fareye 1μl hacminde olacak şekilde nanojektör yardımıyla enjekte edildi. Sistemik yöntemle aktarım için ise, aynı viral genoma sahip AAV9 virüsleri her hayvana 100-150 μl hacimde olacak şekilde farelerin lateral kuyruk veninden insülin iğnesi aracılığıyla enjekte edildi. Hayvanlar 30 gün sonra perfüze edilerek, beyin dokuları çıkarıldı. Dokulardan vibratom aracılığıyla alınan 50 μm kalınlığındaki kesitler GFP eksprese eden hücrelerin görüntülenmesi ve immünohistokimyasal boyamalar için kullanıldı. Floresan boyalı kesitler lazer taramalı konfokal mikroskobuyla, immünohistokimyasal yöntemlerle boyanan kesitler ise ışık mikroskobuyla görüntülendi. Birimalana düşen ortalama GFP- pozitif nöron ve glia hücre oranları hesaplandı.Bulgular:AAV9-GFP virüsünün kuyruk veni aracılığıyla sistemik yoldan enjeksiyonu sonucunda GFP içeren hücrelere ait ışıma beynin rostro-kaudal ekseni boyunca, her iki hemisferde yaygın olacak şekilde incelenen tüm seviyelerde gözlendi. Transdüksiyon düzeyinin glial hücrelerde nöronlara göre çok daha fazla (%80) olduğu gözlendi. Motor korteks koordinatlarına intraparankimal enjeksiyonlar sonrasında ise GFP ışımasının sadece enjeksiyonun yapıldığı beyin hemisferinde lokalize kalacak ve çoğunlukla nöronlarda olacak şekilde (%91) gerçekleştiği gözlendi.Sonuç ve Öneriler:Elde edilen sonuçlar, AAV9 vektörünün beyin hücrelerinde enjeksiyon şekline göre farklılık gösteren yaygın bir transfeksiyon potansiyeline sahip olduğunu göstermektedir. Hedeflenen hücreye spesifik aktarımların gerçekleştirilmesinde uygun serotip ve enjeksiyon yönteminin seçimi kritik bir rol oynamaktadır. Gelecekte, gen aktarımlarında kullanılacak plazmidler ve viral kapsid tasarımlarında yapılacak modifikasyonlar sayesinde trandüksiyon verimliliğinin arttırılması mümkündür.

Imaging of mouse cortical neurons by viral vector mediated gene transferringIntroduction and Aim:In recent years, utilization of viral vectors has been quite frequently preferred for transferring genetic material to cells in the central nervous system. Adeno-associated viruses (AAV) are ideal vectors for gene transferring especially for neural cells, since it provides efficient transduction in both dividing and non-dividing cells with low immunogenicity. The aim of this thesis study was to transfer genes encoding green fluorescent protein (GFP) to cortical motor neurons, one of the specific cellular population in the mouse brain, via different methods and compare their effectiveness by using AAV9 serotype.Materials and Methods:Single-stranded AAV genome was used in the design of plasmid-based recombinant viral vector used for gene transferring. Cytomegalovirus (CMV) promoter, enhanced green fluorescent protein (EGFP), Woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element (WPRE), the beta globin intron and the bovine growth hormone poly (A) were inserted between the two inverted terminal repeat (ITR). Amplification of plasmids was done by transforming them into E. coli bacteria and then they were cut ITR borders to pack into virus capsids. Packaged viral vectors were injected to C57BL/6 mice by two different routes, intraparenchymal and systemic, at postnatal day 45 (for each route, 5 mice have been used). In intraparenchymal delivery, accessing the motor cortex was aimed by using stereotaxic device adjusted to +1.42 mm anterior- posterior and +1.5 mm medio-lateral coordinates according to Bregma reference point. Viral vectors, containing 1012 viral genome, were injected to each mouse at the volume of 1 μl by using a nanojector. For systemic delivery, by using insulin needle, 100-150 μl of AAV9 viruses at the same viral genome titer was delivered to each mouse via lateral tail vein. The animals were perfused after 30 days and brain tissues were removed. For visualization of GFP expression in cells and immunohistochemical staining, the brain tissues were sectioned at the thickness of 50 μm by using vibratome. While laser scanning confocal microscopy was utilized for fluorescence sections, light microscope was used for immunohistochemically labeled sections. Then, the mean GFP-positive neuronal and glial cell ratios per unit area were estimated.Results:As a result of injection of AAV9-GFP virus by the route of tail vein, GFP expression was observed in all levels throughout the rostro-caudal axis ofthe brain, including both hemispheres. Transduction level of glia cells (80%) was much higher than those of neurons by this method. Whereas, following intraparenchymal injections, GFP was expressed mostly in neurons (91%) and was limited into the injected hemisphere side.Conclusion and Suggestions:These results show that AAV9 vector has a wide transfection potency in the brain cells and it can be varied according to the injection methods. Determination of the appropriate serotype and injection method plays a critical role in achieving specific transduction in targeted cells. In future studies, it is possible to improve the efficiency of transduction by modifications on the design of viral plasmids and capsids.