Okzalat oksidaz enziminin izolasyonu ve saflaştırılması

Abstract

56 5 ÖZET Arpa (Hordeum vulgare) çimlerinin okzalat oksidaz enzimini içer diği uzun bir süreden beri bilinmektedir. Okzalat oksidaz enzimi, son yıllarda klinik amaçlı uygulamalar için üzerinde yoğun olarak çalışılan okzalat oksidaz enzim elektrotları için temel materyaldir. Bu sebeble okzalat oksidazın uygun bir kaynaktan ekonomik bir biçim de izolasyon ve saflaştırılması büyük bir önem taşımaktadır. Bu çalışmada, arpa çimi köklerinden okzalat oksidaz izole edildi ve elde edilen preparatın karakteri zasyonu üzerinde çalışıldı. Arpa tohumlarının on gün süreyle oda koşullarında çimlendirilme- si ile elde edilen çimin kökleri enzim izolasyonu için çıkış ma teryali olarak kullanıldı. Çeşitli izolasyon ve saflaştırma teknik lerinin incelenmesi, Km sabitinin tesbiti ve safsızlık yaratan unsurların uzaklaştırılması gibi bir seri çalışma yapıldı. Söz ko nusu çalışmalardan elde edilen verilerin değerlendirilmesiyle yük sek bir aktiviteye sahip çözünür okzalat oksidaz preparatı elde edilmiştir. Blender ile kıyılan arpa çimi kökleri soğuk ( 4 °C) 0,005 M fosfat tamponunda (pH 7,5) homojenize edildi. Birkaç kat tülbent bezinden süzülerek selülozik artıklardan arındırılan homo- jenizatın içerdiği nişasta partikülleri ve hücre enkazı 3000 rpm- de 30 dakika santrifüj lenerek uzaklaştırıldı. Takibeden işlemde, çözel tide kirlilik yaratan unsurların ön uzaklaştırması amacıyla DEAE - Sephadex kolonundan (4x10 cm) yararlanıldı. Çözelti geçişi tamam landığı zaman; kolon, protein çıkışı sona erene kadar 0,05 M fos fat tamponu (pH 7,1) ile yıkandı. Yabancı proteinler, eluatın 80 °C'de 3 dakika bekletilmesiyle denature edildi. Kısa sürede soğutulan çözelti içinde oluşan çökelekler santrifüj lenerek uzaklaş tırıldı. Santrifüjattaki proteinler amonyum sülfat doygunluğunda (%70) çöktürüldü. Santrifüjle elde edilen çökelekler belirli bir57 - hacme seyreltildikten sonra 0,005 M fosfat tamponuna (pH 7,5) karşı 4 °C'de 30 saat süreyle diyal izlendi. İşlem sonunda, diya liz torbalarında oluşan çökelek santrifüj lenerek çözeltiden ayrıldı ve çözeltinin daha yüksek bir enzimatik aktiviteye sahip olduğu bulundu. Çözelti DEAE-Sephadex kolonuna transfer edildi ve kolon sırasıyla 0,005 M (pH 7,5) ve 0,05 M (pH 7,1) fosfat tamponlarıyla yıkandı. Söz konusu iyon değişim kromatografisi ile ayrılan protein fraksiyonları 280 nm'de absorbansları ölçülerek belirlendi. Sonuçta üç ayrı protein fraksiyonunun varlığı tesbit edildi. En yüksek enzimatik aktiviteye sahip fraksiyon suya karşı diyalizlendi. Bu işlemlerin sonunda, çözünür okzalat oksidaz preparatı elde edildi, Sephadex G-200 kolonunda moleküler elek kromatografisi yapıl dı ve okzalat oksidazın molekül kütlesi yaklaşık olarak 150000 Dalton bulundu. Daha sonra disk-jel elektroforezi uygulandı ve yine benzer bir sonuç elde edildi. Bu bulgulara ilave olarak, okzalat oksidaz preparatında metiyonin bulunmadığı tesbit edildi. Bu bul gular literatürle uyumludur. Enzimatik aktiviteye riboflavinin etkisinin incelenmesi ile ilgili denemede, riboflavinin enzimatik aktiviteyi arttırmadığı bulundu. Okzalat oksidazın Michaelis sabiti (K ) 4,3x10` M olarak bulundu. Bunların yanısıra farklı arpa türlerinde enzimatik aktivite- deki değişimler araştırıldı. Sonuçta türü belirli arpalar ile çalışmanın daha olumlu sonuçlar verdiği bulundu.

- 58 - SUMMARY It has been konwn for a long time that barley (Hordeum vulgare) seedlings contain oxalate oxidase. Oxalate oxidase enzyme is a fundamental material for oxalate oxidase enzyme electrodes which have been extensively studied for clinical purposes during recent years. Because of this reason, it is very important the isolation and purification of oxalate oxidase economically from an appropriate resource. In this work, oxalate oxidase was isolated from the roots of barley seedlings and then we have worked on the characterization of this obtained preparation. The roots of barley seedlings, which were obtained by germination of barley seeds in the room conditions in a period of ten days, were used as a starting material for the enzyme isolation. A series of experiments were carried out such as: The examination of different isolation and purification techniques, the determination of the saturation concentration of substrate and Km constant of the enzyme and the removal of impurities. As an evaluation of the date of the above mentioned experiments, a method has been developed and by using this method, a highly active soluble oxalate oxidase preparation was obtained. The roots of barley seedlings were blended with a blender and homogenized in a 0.005 M phosphate buffer (pH 7.5) at 4 °C. This homogenized mixture was removed from cellulosic residues by filtration through a few layers of cheese cloth and then starch particles and residues of cells were removed by centrifugation at 3000 rpm. for 30 minutes. As subsequent treatment, a DEAE-Sephadex column (4 x 10 cm) was used with the purpose of preremoval of impurties. When the elution ceased, the column was washed with a 0.05 M phospate buffer ' (pH 7.1) until no protein is detected. Undesirable proteins were denaturized by keeping the eluate at 80°C for 3 minutes. The solution was cooled within a short time to 4°C and precipitate formed were removed by centrifugation. Proteins in the centrifugate were- 59 - precipitated at 70% amroniun sulfate saturation. This precipitate was diluted to a definite volume and then were dialized against a 0.005 M phosphate buffer (pH 7.5) at 4°C for 30 for hours. At the end of this process, the precipitate formed in the dialysis sacks was removed by centifugation and it was determined that the enzymatic activity of the solution is higher than that of the preciptate. The solution was transferred into a DEAE-Sephdex column and the column was washed with 0.005 M (pH 7.5) and 0.05 M (pH 7.1) phosphate buffers succesively. Protein fractions, which were separated with the ion - exchange chromatography mentioned above were distinguished by measuring of their absorbans at 280 nm. thus the presence of three different protein fractions was determined. The fraction with the highest enzymatic activity, was dialyzed against distilled water. At the end of these processes, soluble oxalate oxidase preparation was obtained. Molecular sieve chromatography was carried out in a Sephadex G-200 column and the molecular mass of oxalate oxidase was determined approximately as 150000 Dalton. The disc-gel electrophoresis method used later confirmed the abouve result. In addition to these findings, it was found that there exists methionine in oxalate oxidase preparation. These data conform with the literature. In the experiment related to the influence of riboflavin to enzymatic activity, it was discovered that riboflavin does not increase enzymatic activity. Michael is constant of oxalate oxidase was found -4 as 4.3 x 10 M. The changes in the enzymatic activity of different species of barley were also investigated. At the end of these investigations, it has been concluded that working a definite species of barley gives more reliable results. ^jS***8*^