İnulinaz enziminin üretimi ve üretim kinetiklerinin belirlenmesi

Abstract

- 73 - 6. ÖZET Endüstriyel uygulamalarda biyolojik katalizör olan enzimlerin kullanımının artmasına paralel olarak endüst riyel enzim üretimi de artış göstermiştir. Endüstriyel - enzim üretiminde mikroorganizmalar sahip oldukları potansiyel nedeniyle bitkisel ve hayvansal kaynakla ra tercih edilmektedir. Mikrobiyal enzim üretiminde, mikroorganizmanın ihtiyaç duyduğu ortam parametrele rin proses ekonomisi yaklaşımı ile optimize edilmesi çalışmaları, tarımsal atıklar gibi işlenmemiş mater yalin ya da bugüne kadar endüstriyel boyutlarda kulla nımı sözkonusu olmamış, yeni kaynakların kullanımını ortaya çıkarmıştır. Son yıllarda inulin içeren tarım sal ürünlerin alternatif kaynaklardan biri olabileceği konusunda çalışmalar yapılmaktadır. Yerelması hindiba, yıldız çiçeği inulince zengin kaynaklara örnek verile bilir. İnulin, B-2,1 bağlı ve molekül sonunda bir glu- koz ünitesi olan fruktoz polimeridir. Bu polimerin inulinaz enzimi ile hidrolizlenerek serbest şekerleri enerji kaynağı olarak kullanan biyoteknolojik proses lere alternatif kaynak sağlanırken, gıda sanayinde doğal tatlandırıcı olarak kullanılan yüksek fruktoz içerikli şurup ve saf fruktoz üretimini gerçekleştir mek de mümkün olacaktır. inulinaz, çeşitli maya, bakteri ve küf mantarla rı tarafından hücre içi veya hücre dışı olarak üreti len ve üretimi indüksiyon mekanizması ile kontrol edilen bir enzimdir. Bu enzimin üretiminde yüksek şeker içerikli ortamdan izole edilen ve tanımlaması yapılan 31 Aspergillus niger şuşu taranmıştır, üreme ortamı kompozisyonunun yüksek aktivitede enzim üretimi74 - yönünde optimize edilmesinde değişik organik ve inorga nik azot kaynakları ve substrat konsantrasyonları denenmiştir. Elde edilen sonuçlar, 0.226 g/L NH4N0g, 0.374 g/L (NH4)2 HP04, 1.5 g/L Maya Ekstraktı, 1.0 g/L KH2P04, 0.5 g/L MgS04 ve % 1 Yerelması içeren üreme ortamında taranan şuşlardan Aspergillus niger A42'nin 10 spor/ml spor süspansiyonu aşılaması ile 28 C sıcak lıkta, 200 rpm'de çalkalamalı inkübatörde 96 h süreli üretim sonunda 36 U/ml aktiviteye sahip inulinaz üre tilebileceğini ortaya koymuştur. Enzim üretimi ve akti- vitesi üzerine üreme ortamında bulunan partiküllerin ve fenolik bileşiklerin etkisi görülmemiştir. üretilen inulinaz enzimi 50°C sıcaklıkta pH 5'te maksimum aktivite göstermektedir, inulinazın termosta- bil özelliğini ve pH çalışma aralığını ortaya koyabil mek amacıyla değişik sıcaklık ve pH değerlerinde enzim substratsız olarak 1 h süre ile bekletilmiştir. Süre sonunda 60°C sıcaklıkta inuline karşı aktivitenin %77 sini, 65°C sıcaklıkta % 33'ünü korunabildiği, pH çalış ma aralığının 5-6 olduğu belirlenmiştir. Yapılan diğer çalışmalar ile karşılaştırıldığında A. niger A42 kullanılarak üretimi gerçekleştirilen inu linazın termostabil özelliği, sahip olduğu pH çalışma aralığı ve yüksek aktivitede enzim sentezine (50 U/ml) ulaşması (120 h) endüstriyel hidroliz proseslerine uygunluğunu arttırmaktadır. Yakın gelecekte inulinazın biyoteknolojik proseslerde ve gıda sanayinde yaygın olarak kullanılacağı inancı taşınmaktadır.

75 7. SUMMARY Enzymes are biological catalysts which have found increasing applications in the industry. Production of enzymes have thus paralleled this demand. Microorganis ms have been preferred againts plant and animal sources for enzyme production due to their high productivity potentials in microbial enzyme production. The growth conditions and the parameters which effect the process need to be optimized which ultimately determines the process economy. The raw material greatly contributes to the final product cost, therefore alternative raw materials such as Jerusalem artichoke, dahlia, chicory have been suggested as alternative substrates for such processes. In common, these substrates have a very high inulin content. Inulin is a B -2,1 linked fructose polymer with a glucose molecule at the end of this polymer. However, in biotechnological processes this polymer needs to be hydrolized into free sugars in order to be used as an energy and carbon sources. Similarly inulin can also be used as an alternative natural sweetner provi ded that it is hydrolized and concentrated. For the selection of inulinase producing organizm, 31 A.niger strains have been screened which were previously identified in our department and TÜBİTAK for aflatoxin production. Growth media composition was optimized by supplementing with nitrogen, phospho- rousmagnesium and yeast extract in appropiate quanti- Q ties. Spor inoculum at 10 /ml gave better results than mycelium inoculum and an enzyme activity of 36 U/ml was achieved in 96 h of incubation. These results com pared favourobly with the results reported in the literature. Presence of particulate material or76 - phenolic compounds from the Jerusalem artichoke skins did not significantly effect the enzyme production. For the determitation of inulinase activity a tem perature of 50°C and pH 5 was found to be optimum. However enzyme stability measured for one hour without the substrate at various temperatures showed that 77 % of the activity was retained at 60°C and 33 % retained at 65°C. For these temperatures pH stability was found to be between 5-6. Investigations using A.niger A42 strain showedthat it was possible to obtain an enzyme preparation with 50 U/ml activity against inulin within 120 h of incuba tion. Compared to previously reported data, a 50 % reduc tion in process time was possible with simultaneous achievement of the same level of activity. In near future, It is projected that inulinase enzyme will find a wider application both in the food industry and in other biotechnological processes.