The investigation of the protolytic equilibria in the excited states of L-tyrosine, L-phenylalanine and L-tryptophan by spectrophotometric and spectrofluorometric methods

Abstract

V ÖZET L-TİROZİN, L-FENİLALANİNİN VE L-TRİPTOFAN'IN UYARILMIŞ HALDEKİ PROTOLİTİK DENGELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİK VE SPEKTROFLOROMETRİK METODLARLA İNCLENMESİ ORBAY, Deniz Güner Yüksek Lisans Tezi, Kimya Bölümü Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Aysel TEMİZER Mayıs 2004, 139 sayfa L-tirozin, L-fenilalanin ve L-triptofamn uyarılmış haldeki protolitik dengeleri, spektrofotometrik ve spektroflorometrik metodlar kullanılarak oluşturulan florometrik titrasyon eğrileri yardımıyla incelenmiştir. L-Tirozine ilişkin asidik bölgede elde edilen florometrik titrasyon eğrisi - COO` grubunun protonlanmasma ilişkin protolitik dengeyi göstermektedir. Asidik bölgede bu dengeye ilişkin uyarılmış hal dengesi kurulamadığından florometrik titrasyon eğrisinin dönüm noktasından bu dengeye ilişkin temel hal pKa değeri 2.7 şeklinde bulunmuştur. L- Tirozine ilişkin bazik bölgede elde edilen florometrik titrasyon eğrisi ise fenolik hidroksil grubunun deprotonasyonuna karşılık gelen protolitik dengeye ilişkindir. L-Tirozinat oluşumu ile floresans spektrumu 345.9nm'ye doğru kaymaktadır. Bu nedenle bu dengeye ilişkin pKa değeri Förster çevrimi metodu kullanılarak 4 şeklinde bulunmuştur. L- Tirozin yapısındaki -NH3+ grubunun protolitik dengesine ilişkin pKaVI ve/veya pKa değeri amino grubunun kronıofor grupla etkileşimi olmadığından dolayı spektrofotometxik ve spektroflorometrik yöntemlerle tayin edilemez. L-Fenilalanin için elde edilen asidik bölgedeki florometrik titrasyon eğrisi -COO` grubunun protonlarıma dengesine ilişkindir. Bu eğrinin dönüm noktasından -COOH grubuna ilişkin temel hal pKa değeri yaklaşık olarak 2.6 bulunmuştur. Yine L-fenilalanine ilişkin bazik bölgedeki florometrik titrasyon eğrisinin dönüm noktası -NH3+ grubuna ilişkin pKa değerine karşılık gelir. pKa* değeri yaklaşık olarak 8,9 bulunmuştur. Son olarak L-triptofana ilişkin pH 1 ve 10,5 arasında elde edilen florometrik titrasyon eğrilerinin dönüm noktalan sırasıyla 2,4 ve 9,4'tür. Bu değerler sırayla -COOH ve -NH3+ gruplarının temel hal protilitik dengelerinin pKa değerlerine çok yakındır. Bu durumda pH değeri 1 ve 10,5 arasında olan L-trp çözeltileri için floresansdan önce uyarılmış hal dengelerinin kurulamadığı anlaşılır. Asidik bölgede elde edilen florometrik titrasyon eğrisinin karşılık geldiği protolitik denge -COOH grubunun protonlarıma dengesidir. Bu dengeye ilişkin temel hal pKa değeri ise 0,5 olarak bulunur. Son olarak bazik bölgedeki florometrik titrasyon eğrisi, indol grubunun deprotolanma dengesine ilişkin olup bu dengeye ilişkin pKa* değeri ise 12,1 olarak bulunmuştur. Anahtar Sözcükler: L-tirozin, L-fenilalanin, L-triptofan, uyarılmış hal asitîik sabiti, uyarılmış hal asit-baz dengeleri, florometrik titrasyon eğrisi, sürekli haller floresansı

VII ABSTRACT THE INVESTIGATION OF THE PROTOLYTIC EQUILIBRIA IN THE EXCITED STATES OF L-TYROSINE, L-PHENYLALANINE AND L-TRYPTOPHAN BY SPECTROPHOTOMETRY AND SPECTROFLUOROMETRIC METHODS ORBAY, Deniz Güner Master Thesis in Chemistry Supervisor: Prof. Dr. Aysel Temizer May 2004, 139 pages The excited-state protolytic (acid-base) equilibria of L-tyrosine, L- phenylalanine and L-tryptophan have been investigated by the aid of fluorometric titration curves using the spectrophotometric and spectrofluorometric methods. The fluorometric titration curve of L-tyr in the acidic region corresponds to the protolytic equilibrium of the protonation of the -COO` group. As the excited - state protolytic equilibrium is not completely estabilished, the inflection point of the fluorometric titration curve gives the ground state pK& value at 2,7. The florometric titration curve obtained in the basic region corresponds to the deprotonation equilibrium of the phenolic hydroxyl group. Due to the formation of L-tyrosinate, the fluorescence spectra shift from 304nm to 345,9nm and the absorptionVIII spectra shift from 275nm to 294nm. Therefore, the pKa value of the protolytic equilibrium was calculated by Förster cycle method and was found as 4. The pK* and/or pKa value of the ammonium group of L-try cannot be determined by absorption and fluorescence studies as the ammonium group hardly interacts with the chromophoric group. The fluorometric titration curve for L-phe obtained in the acidic group corresponds to the protonation of the -COO` group. From the inflection point of this curve the ground state pKa value for -COOH group was found as 2,6. The inflection point of the fluorometric titration curve obtained in the basic region gives the pKa value of-NH3+ group at 8,9. Finally, the inflection points of the fluorometric titration curves between the pH values of 1 and 10,5 are 2,4 and 9,4. These values are very close to the ground state pKa values of the -COOH and -NH3+ groups. Thus, the excited - state protolytic equilibria of these functional groups are not completely established before the fluorescence occurs. The fluorometric titration curve obtained in the acidic region corresponds to the protolytic equilibrium of the protonation of -COOH group. The pKa value of this equilibrium was found from the inflection point as 0,5. Finally, the fluorometric titration curve obtained in the basic region corresponds to the deprotonation equilibrium of the indole group and the pKa value of this equilibrium was found as 12,1. Key Words: L-tyrosine, L-phenylalanine, L-trytophan, excited-state acidity constants, excited-state acid-base equilibrium, fluorometric titration curve, steady state fluorescence