Arap Kızı yerel elma çeşidinde polifenol oksidaz enziminin saflaştırılması, karakterizasyonu, bazı killerle immobilizasyonu ve inhibisyon etkilerinin incelenmesi

Abstract

Isparta ilinde yetiştirilen yerel elma çeşidimiz olan Arap kızı elmasından (Malus domestica) polifenol oksidaz enzimi (PPO) saflaştırılmıştır. Polifenol oksidaz enzimi fosfat tamponunda izole edildikten sonra amonyum sülfat çöktürme, diyaliz ve Sepharose 4-B-L-tirosin-p-aminobenzoik asit afinite jelinin ardarda kullanılmasıyla saflaştırılmıştır. SDS-PAGE ile enzimin molekül ağırlığı hesaplanmıştır. Optimum pH ve sıcaklık değerlerini belirlemek için farklı pH değerlerinde (4.5-9.0) ve farklı sıcaklık aralığında (10-45◦C) üç farklı substrat kullanılarak aktivite ölçümleri yapılmıştır. Arap kızı PPO enziminin farklı substratlara karşı KM ve Vmax değerleri Linewear-Burk yöntemi ile katekol substratı için 50 mM ve 2500 U/mLdak; 4-metil katekol substratı için 2 mM ve 2000 U/mLdak; pirogallol substratı için 6 mM ve 10000 U/mLdak olarak bulunmuştur. Pirogallol substratının Arap kızı PPO enzimi için en uygun substrat olduğu belirlenmiştir. Pirogallol substratı için optimum pH 8.5 ve optimum sıcaklık 10◦C olarak bulunmuştur.Saflaştırılan PPO enziminin üç farklı kile (kırmızı, yeşil ve beyaz) immobilizasyonu gerçekleştirilmiştir. PPO enziminin immobilize edildiği ve ölçüm sırasında eklendiği serbest enzim için inhibisyon tipleri, IC50 ve Ki değerleri belirlenmiştir. Hem immobilize enzim hem de serbest enzim için en etkili inhibitörün beyaz kil olduğu belirlenmiştir.

The Polyphenol oxidase enzyme was purified from Arap kızı apple (Malus domestica), a local apple cultivar, grown in Isparta province. The PPO enzyme was extracted in phosphate buffer and purified by the sequential use of ammonium sulfate precipitation, dialysis, and Sepharose 4-B-L-tyrosine-p-aminobenzoic acid affinity gel. The enzyme molecular weight was estimated by SDS-PAGE.To determine the optimum pH and temperature values, the activities were measured using three different substrates at different pH (4.5-9.0) and temperature ranges (10-45˚C). KM and Vmax values of PPO enzyme against different substrates were determined by the Linewear-Burk method as 50 mM and 2500 U/mLmin for catechol substrate; 2 mM and 2000 U/mLmin for 4-methyl catechol substrate; 6 mM and 10000 U/mLmin for pyrogallol substrate. Pyrogallol substrate was found to be the most suitable substrate for the PPO enzyme. Optimum pH was 8.5 and optimum temperature was 10˚C for the pyrogallol substrate.Purified PPO enzyme was immobilized on to three different clays (red, green and white). Inhibition types, IC50 and Ki values for immobilized PPO and free enzyme, which was added during the measurements, were determined. The most effective inhibitor for both the immobilized and the free enzyme was white clay.