Bor hiperakümülatör bitkilerde mir408 ve bor2 genlerinin yüksek düzeyde ifadesinin bor fitoremediasyonuna etkileri

Abstract

Bu çalışmada miR408 geninin pamuk ve karanfil bitkilerine Agrobacteriumaracılığıyla genetik transformasyonu gerçekleştirilmiştir. Transgenik bitkilerinrejenerasyonu her iki bitki içinde gerçekleştirilmiştir. Ancak F1 eldesi yalnızcapamuk bitkisinde gerçekleştirilebilmiştir. miR408 geninin bor fitoremediasyonpotansiyeli F1 jenerasyon transgenik pamuk bitkilerinde moleküler ve biyokimyasalseviyede incelenmiştir. Bu amaçla transgenik ve kontrol pamuk bitkilerine 1. gün ve5. gün 7.5 mM olmak üzere iki farklı süreyle şiddetli bor stresi uygulanmış vetepkiler karşılaştırılmalı olarak incelenmiştir.mir408 geninin varlığının transgenik bitkilerde artan bor stresi altında PIP1;1 genifade seviyesini artırdığı belirlenmiştir. Benzer şekilde PIP2;1 gen ifade seviyesitransgenik bitkilerde artan bor stresi ile birlikte artmaktadır. MDA ve iyon sızıntısımiktarları, transgenik bitkilerin bor uygulamaları altında bor uygulanan kontrolbitkilere göre üstün dayanım özelliği gösterdiğini ve daha az strese girdiğinigöstermektedir.Transgenik bitkiler bor stresinin ilk gününde aşırı borla karşılaştığında Borontransporter 1 geninin ifadesini azaltarak bitkilere bor girişini azaltmıştır. Ancak 5günlük stres sonunda, bu genin ifadesinin artarak bitkilere bor girişinin arttığı tespitedilmiştir. miR408 geninin, boron transporter 1 geninin ifade seviyesinidüzenleyerek bitkilerin bor dengesinin sağlanmasında görev aldığı belirlenmiştir.Transgenik bitkilerde Boron transporter 2 gen ifadesinin, stres süresi uzadıkça arttığıbelirlenmiştir. Birinci stres gününde Boron transporter 2 gen ifadesinin transgenikbitkilerde düşük olmasının bir nedeninin Boron transporter 1 geninin ifadeseviyesini düşürerek bitki içerisine bor alınımını azaltması nedeniyle olduğu tespitedilmiştir.Bağıl su içerikleri, transgenik bitkilerde 1. stres gününde kontrol bitkilerden dahayüksek yüzdeye sahip ve istatistiksel olarak önemli iken, 5. stres gününde buyüzdenin düşerek bor uygulanan kontrol bitkileri ile aynı seviyeye geldiğibelirlenmiştir. Prolin içerikleri transgenik bitkilerde 1. stres gününde bor uygulanankontrol bitkilerin seviyesinin altındayken, 5. stres gününde artmıştır. Bu sonuçlar Boron transporter 1 ve Boron transporter 2 genleri arasındaki ilişkiyi desteklerniteliktedir.Plastosiyanin gen ifadesinin stresle birlikte arttığı belirlenmiştir. Birinci stresgününde transgenik bitkilerde plastosiyanin gen ifadesi bor uygulanan kontrolbitkilerine göre daha düşük seviyede kalırken, 5. stres gününde kontrol bitkilerindendaha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Plastosiyanin‟in bakır eksikliğinde ifade edilenbir gen olduğu bu nedenle artan stres koşullarında bitkinin bakır ihtiyacı duymasınedeniyle arttığı belirlenmiştir. miR408 geni, artan bor stresi (5. gün) altındatransgenik bitkilerde plastosiyanin gen ifadesini düzenleyerek bor uygulanan kontrolbitkilerine kıyasla %11 artırmıştır.Transgenik bitkilerin toplam klorofil içerikleri, 1.stres gününde bor uygulanankontrol bitkilerinden yüksek olmasına rağmen istatistiksel olarak önemlibulunmamıştır. Beşinci gün bor stresinde transgenik bitkilerin toplam klorofiliçerikleri, bor uygulanan kontrol bitkilerden daha yüksek seviyede olup istatistikselolarak önemli bulunmuştur. Transgenik bitkilerin toplam klorofil içeriklerini artanbor stresiyle birlikte, kontrol bitkilerine kıyasla daha iyi düzeyde koruduğu tespitedilmiştir. miR408 geninin bor stresi altında MAPK ve CPR2 gen ifadelerinindüzenlenmesinde etkin bir rol oynamadığı anlaşılmıştır. EF1A8‟in bor stresi altındakullanılabilecek uygun bir referans gen olduğu belirlenmiştir.

In this study, genetic transformation of miR408 gene to cotton and carnation plantswas carried out via Agrobacterium. The regeneration of transgenic plants wasperformed successfully in both plants. However, F1 seed production could only beachieved in cotton plants. Boron phytoremediation potential of miR408 gene wasinvestigated at the molecular and biochemical level by the use of F1 generationtransgenic cotton plants. For this purpose, severe boron stress was applied to thetransgenic and control cotton plants at two different durations, namely 1 day and 5days at the rate of 7.5 mM B and the responses were examined comparatively.The mir408 gene was found to increase the expression level of PIP1;1 gene underlong term boron stress in transgenic plants. Similarly, the PIP2;1 gene expressionlevel increased with increasing boron stress in transgenic plants. Levels of MDA andion leakage indicated that transgenic plants were more tolerant to boron stres whencompared to control plants.Boron transporter 1 gene expression level decreased in transgenic plants whenencountered with excesss boron on the 1st day of stress. However, at the end of the5th stress day, increased expression of this gene was found to increase boron input tothe plants. The miR408 gene was determined to regulate the expression level ofboron transporter 1 gene in the provision of boron balance in plants. Similarly borontransporter 2 gene expression was increased with the exposure of longer stressduration in transgenic plants. The reason for the lower Boron transporter 2 geneexpression in transgenic plants on the 1st day of stress might be resulted from thedecrease of Boron transporter 1 gene expression and eventually decreased boronintake of plant tissues.Plant relative water content percentages (%) were higher and statistically significantin transgenic plants compared to control plants under boron stress on the 1st day ofstress, while this percentage decreased and found to be statistically insignificantbetween transgenic and boron stressed control plants on the 5th day of stress. Plantproline contents did not exhibit statistically significant difference in transgenic plantswhen compared to boron stressed control plants on the first day of stress; howeverthe difference increased at the duration of five days. These results also supported therelationship between Boron transporter 1 and Boron transporter 2 genes.The expression of plastocyanin gene was increased with the duration of stress. Onthe 1st day of stress, plastocyanin gene expression in transgenic plants was found tobe lower than boron stressed control plants, whereas it was found to be higher on the5th day of stress when compared to boron stressed control plants. Plastocyanin is agene expressed in the lack of copper; however plants are unable to absorb essentialcopper under increased stress conditions. This might be the reason for theplastocyanin gene expression increase under long stress duration. miR408 geneseems to regulate plastocyanin gene expression under long stress duration intransgenic plants with 11% more expression compared to boron stressed controlplants.Although the total chlorophyll content of transgenic plants was higher than boronstressed control plants at the 1st day of stress, the difference was not statisticallysignificant. However, at the 5th day of boron stress, increase in the total chlorophyllcontent of transgenic plants compared to boron stressed control plants wasstatistically significant. Therefore, transgenic plants have been found to maintaintheir total chlorophyll contents under severe boron stress when compared to boronstressed control plants. The miR408 gene was found to play no effective role in theregulation of MAPK and CPR2 gene expressions under boron stress. EF1A8 wasfound to be a suitable referance gene which can be used under boron stres.