Pseudomonas aureofaciens`de mcl-polihidroksialkanoatların hücre içi yıkım metabolitlerinin GC-MS ile profillenmesi

Abstract

Polihidroksialkanoatlar (PHA), aşırı karbon kaynağının bulunduğu azot sınırlamalı stress koşulları altında bakterilerde granüler halde enerji rezervi depolanan biyopolimerlerdir. Fiziksel ve kimyasal özelliklerinin petrol-türevli polimerlere benzer oluşu bu biyopolimerlerin petrol-türevli plastiklerin yerini alabilmesine olanak sağlamaktadır. Aynı zamanda biyouyumlu ve biyobozunur özellikte olmaları nedeniyle PHA'lar doku mühendisliği ve biyomedikal alanında da kullanım potansiyeline sahiptir.Endüstriyel olarak üretimi ve kullanım açısından üzerine yapılmış ve devam eden birçok çalışma bulunmaktadır. Yapılan bu çalışmalar ağırlıkla üretim veriminin arttırılması ve kullanım potansiyelleri yönündedir. Ancak üretici mikroorganizmada yıkım da devam etmektedir. Bu işlem ise hücre içi PHA depolimerazlar olarak adlandırılan enzimler tarafından yapılmaktadır. PHA sentezinin arttırılması yanında, yıkımının da bloke edilmesinin/hızının azaltılmasının üretim verimini daha da arttıracağı açıktır. Bu işlemin getireceği bir diğer avantaj, üretim süresinin azalması, üretim maliyetinin düşürülmesi anlamına gelmektedir. Mevcut literatürler incelendiğinde PHA'ların hücre içi yıkım yolaklarının belirlenmesi üzerine yapılmış araştırmalar oldukça azdır.Bu tez çalışmasında, PHA üretici olarak olarak Pseudomonas aureofaciens seçilmiştir ve karbon kaynağı olarak oktanoik asit kullanılarak üç farklı koşulda mcl-PHA metabolizması incelenmiştir. PHA üretiminin teşvikdildiği, açlık ve PHA üretiminin teşvik edilmediği koşullarda belirli periyotlarla örnek alınarak bu örneklerdeki PHA profilleri çıkartılmış ve yağ asidi türevli metabolitler GC-MS ile analizlenmiştir. Yapılan analizler sonucu elde edilen metabolitlerden 3-hidroksioktanoat, trans/cis-3-oktenoik asit ve 2-oktenoik asidin doğrudan poli-3-hidroksikoktanoat (PHO) metabolizmasıyla ilşkili olduğu ve polimerin biyosentez ve yıkımının bu metabolitler üzerinden gerçekleştiği düşünülmektedir. Diğer metabolitlerin ise dolaylı yollardan temel metabolitlerin ileri dönüşüm ürünleri veya organizmanın rutin metaboliti olduğu düşünülmektedir.Elde edilen bu veriler ile PHO metabolizmasının anlaşılmasına yardımcı olabilecek literatür bilgisinin sağlanacağı düşünülmektedir.

Polyhydroxyalkanoates (PHA) are biopolymers and stored in the cell in granular form as energy reserve by bacteria under stress conditions such as the limited nitrogen and excessive carbon sources. These biopolymers are alternative to petroleum-derived polymers because they have different physical and chemical properties. Also they are biocompatible and biodegradable so PHAs can be used in most of biomedical applications including tissue engineering as a tissue scaffold, controlled drug release and biomedical implants.There are lots of ungoing studies about their production and applications. These investigations are focused on increasing production yields and defining the potential applications. However, producing microorganisms are also capable to degrade polyhdroxyalkanoates. Enzymes called as intracellular PHA depolymerases carry out this process.PHA production yield can be increased by increasing PHA synthesis and by decreasing of PHA degradation rate or blocking the degradation metabolism. This process also provides reducing the cost of production and minimizing of production time. Although the recent literature gives information about extracellular PHA degradation, there is not enough knowledge about determination of intracellular degradation pathways.In this study, Pseudomonas aureofaciens was used as PHA producer organism. Octanoic acid was used as carbon source and mcl-PHA metabolism was investigated in three different metabolic conditions. Fatty acid based metabolites were analysed with GC-MS in induced PHA producing, starving and non-induce PHA producing conditions and PHA profiles were obtained. As a result of analysis, it was found that 3-hydroxyoctanoate, trans/cis-3-octenoic acid and 2-octenoic acid are directly related with poly-3-hydroxyoktanoate (PHO) metabolism and biosynthesis and degradation of polymer are occured due to these metabolites. Furthermore, it was suggested that, the other metabolites are further transformation products of the main metabolites or common metabolites of organism. According to these results, this project will provide basic knowledge about PHO metabolism.