Elektrokimyasal hibridizasyon indikatörleri kullanarak DNA dizilerinin saptanması

Abstract

102 ÖZET Çalışmamızda, hibridizasyon indikatörü olarak kullanılması planlanan, organik boyar bir madde olan Metilen Mavisi (MB)' nin DNA ile etkileşmesi, yüzeyine ayrı ayrı çift sarmal DNA (dsDNA) ve tek sarmal DNA (ssDNA) tutturulan karbon pastası (CPE) ve perde baskılı (=screen printed, SPE) elektrot kullanarak, kare dalga voltametri (SwV), diferansiyel puis voltametri (DPV) ve dönüşümlü voltametri (CV) teknikleri ile elektrokimyasal olarak incelendi. ssDNA ile, dsDNA ile alınan yanıta oranla çok daha büyük bir yanıt elde edildi. Yanıtlar arasındaki anlamlı farka dayanarak, MB' nin yeni bir hibridizasyon indikatörü olarak kullanılabileceği saptandı. Yöntemin optimizasyonuna yönelik çalışmalar da gerçekleştirildi. Bulaşıcı ve kalıtsal hastalıkların, çevresel kirliliğine neden olan mikroorganizmaların ve özellikle besin endüstrisinde önemli bir yeri olan genetik olarak değişikliğe uğratılmış organizmalara (GDU) ait gen dizilerinin daha kısa sürede, daha özgün ve güvenilir şekilde tayinini mümkün kılacak, hibridizasyona dayalı elektrokimyasal DNA biyosensör tasarımı yapıldı ve PCR ürünü örneklerde yapılan dizi tayini çalışmaları ile biyosensörlerin klinik alanda uygulanabilirliği gösterildi. MB'nin indikatör olarak kullanıldığı indikatöre dayalı DNA biyosensörü ile, DNA dizisi belli hastalıklardan, son derece güncel olan Hepatit B virüsünün (HBV) ve kan nakli yoluyla aktarılan, nedeni henüz bilinmeyen yeni DNA virüsünün (TTV) tayini gerçekleştirildi. HBV ye ait dizi tayini, hem sentetik oligonükleotitler kullanılarak, hem de klinik kullanımını göstermek amacıyla, PCR ürünü hasta örnekleri kullanılarak yapıldı. TTV' ye ait dizi tayini ise sadece PCR ürünü hasta örnekleri kullanılarak gerçekleştirildi. Ayrıca, soya'dan elde edilen örneklerde GDU' ya ait dizinin tayini de gerçekleştirildi. Hibridizasyon koşulları optimize edildi ve tasarımı yapılan DNA biyosensörünün seçiciliği incelendi.

103 SUMMARY In this study, the interaction of organic dye, MB which is planed to use as a hybridization indicator, with DNA was studied at the dsDNA modified and ssDNA modified CPE and SPE's by using SWV, CV, DPV techniques. Due to the lesser interaction between the dsDNA modified electrodes and MB, a relatively smaller peak current was observed when compare with the one obtained with the ssDNA modified electrodes. As a result, it was determined that MB can be used as a new hybridization indicator, due to the differences between dsDNA and ssDNA modified electrodes. The experimental parameters for this study was also studied. Indicator based electrochemical DNA biosensors for the spesific and reliable detection of infectious and inherited diseases, microorganisms which cause environmental pollution and genetically modified organisms which are important for the Food Industry have been developed. The applicability of the DNA biosensors in clinical fields was shown by sequence detection studies which are performed with PCR amplified real samples. The sequence detection of the common infectious disease virus, HBV and the new DNA virus which is called Transfusion Transmitted Virus, TTV have been performed with indicator based DNA biosensors which use MB as the hybridization indicator. The sequnce detection of HBV has been performed not only with synthetic oligonucleotides but also with PCR amplified real samples to prove its clinical utility. The sequence detection of TTV has been performed with only PCR amplified real samples. The sequence detection of GMO has been also performed with DNA biosensor. The conditions for the hybridization were optimized and the specificity of the DNA biosensor was investigated.