Çürüklü ve çürüksüz dişlerden izole edilen streptococcus mutans`ın genotipik ayrımlarının AP-PCR (arbitrarily-primed polymerase chain reaction) yöntemiyle incelenmesi

Abstract

Çalışmamızda kötü ağız hijyenine sahip yaşlan 13 ile 35 arasında değişen 20 hastanın sağlam diş yüzeylerindeki dental plaktan steril tahta kürdanlar ve çürük kavitelerinden ekskavatörler ile alman dekalsifiye dentin örnekleri seyreltme işlemlerinden sonra TYCSB agar besiyerine ekimleri yapıldı. Referans olarak Streptococcus mutans NCTC 10449 ve Streptococcus mutans CNCTC 8/77 suşları kullanıldı. 37° C'de %5 CO2 ile inkübasyondan sonra her iki bölgeden de üreme gözlenen ve koloni morfolojisi referans suşlarla benzerlik gösteren 28 S. mutans izolatına karbonhidrat fermentasyonu, arginin ve eskülin hidrolizi, basitrasin dirençliliği, katalaz, hemolizin üretimi ve Voges-Proskauer testleri uygulanarak fenotipik identifikasyonları gerçekleştirildi. Test sonuçlarına göre Streptococcus mutans olduğu saptanan izolatlara genotipik ayrımlarım belirlemek amacıyla polimeraz zincir reaksiyonu uygulandı. Streptococcus mutans için spesifik olduğu bildirilen OPA-05 ve OPA-13 primerleri kullanılarak gerçekleştirilen AP-PCR sonucunda elde edilen Streptococcus mutans' a ait DNA bant yapılan Streptococcus mutans NCTC 10449 referans suşunun DNA bant yapısı ile karşılaştınldı. OPA-05 primeri ile 194 ve 603 baz çiftlerinde; OPA-13 primeri ile 603, 872 ve 1353 baz çiftlerinde referans suş ile ortak bant yapılan belirlendi. Sağlam diş yüzeylerinden ve çürük kavitelerinden elde edilen Streptococcus mutans izolatlarına ait DNA bantlarının değerlendirilmesinde homolog olan bantların var olma ya da olmama durumlarına göre oluşturulan benzerlik indekslerinden yararlanıldı. OPA-05 ve OPA- 13 primerleri için ortalama benzerlik indeksleri arasındaki fark anlamlı bulunmadı. Çalışmamızda Streptococcus mutam NCTC 10449 referans suşunda polimeraz zincir reaksiyonu sonucunda elde edilen AP-PCR ürünleri incelendiğinde karyojenik olduğu bilinen referans suştaki belirgin bantların çürük kavitesinden ve plak örneklerinden elde edilen izolatlarda da görüldüğü belirlendi. Karyojenik olduğu düşünülen izolatlardaki bu belirgin DNA bantlarmdaki spesifik genlere özgü DNA probları ile Streptococcus mutans'm karyojenitesini belirlemeye yönelik daha ileri çalışmalar planlanması konunun gelişimine katkıda bulunacaktır.

In this study, a total of 40 tooth site samples were obtained from twenty 13 to 35 year- old patients with poor oral hygiene. Plaque samples from sound tooth surfaces were gathered using sterile wooden toothpicks and deep layers of carious dentin were removed by sterile excavators. Serially-diluted samples were cultured on TYCSB agar. Streptococcus mutans NCTC 10449 was used for reference strain. All plates were incubated at 37°C with 5%C02 for 48 h. When samples exhibited growth, colonies resembling S. mutans were detected. 28 isolates that exhibited growth from both tooth sites were included in the study. For identification these 28 isolates were tested for their ability to ferment sorbitol, mannitol, melibiose; to cleavage arginine and esculin and to resist to bacitracine. After biochemical tests were performed, isolates were AP-PCR typed. The AP-PCR patterns were compared to those obtained with S. mutans NCTC 10449. PCR amplification was performed using OPA-05 and OPA-13 primers. The AP-PCR fingerprints were analyzed by side-by-side visual comparison. OPA-05 distinguished two main PCR patterns among isolates. The isolates shared a strong AP-PCR product 194 bp and 603 bp. With OPA-13, three stong patterns 603, 872 and 1353 bp in size. The difference between the similarity indices for OPA-05 and OPA-13 was not statistically significant. For further studies, it is planned to investigate the cariogenicity of the isolates using DNA probes specific to the genes related with the strong AP-PCR amplicons.