Çeşitli bulaşıcı ve kalıtsal hastalıklara neden olan gen dizilerini içeren PCR ürünü örnekler kullanılarak elektrokimyasal DNA biyosensörleriyle bu hastalıkların saptanması

Abstract

90 ÖZET Bu çalışmada, elektrokimyasal DNA biyosensörlerine dayalı indikatörlü ve indikatörsüz DNA dizi algılama yöntemleri geliştirildi, bu yöntemlerin kalıtsal ve bulaşıcı hastalıkların tayininde klinik olarak uygulanabilirliği gerçek hasta örnekleri kullanılarak gösterildi. Çalışmada ilk olarak interkalatif özelliği ile hibridizasyon indikatörü olarak kullanılan Meldola Blue (MDB) ile, indikatörlü DNA dizi algılama yöntemine dayalı; genomları bakımından birbirlerine çok benzeyen, vücutta oluşturduğu enfeksiyon bölgeleri bakımından farklılık gösteren Herpes Simplex (HSV) Tip I ve Tip II virüslerinin tayini ve birbirlerinden ayırımı gerçekleştirildi. Hastalığın tayini ve iki tip virüsün birbirinden ayırımı, her iki tipe ait prob kullanılarak, hem sentetik oligonükleotitler ile hem de hasta örneklerinden hazırlanmış PCR ürünleri ile gerçekleştirildi. Çalışma elektrot yüzeyine kovalent olarak bağlanan prob dizilerin hedef diziler (sentetik oligonükleotitler ve denature edilmiş PCR ürünleri) ile hibridizasyonundan sonra MDB ile etkileşimlerinin ardından MDB sinyallerindeki farklılıkların diferansiyel puis voltametresi (DPV) ile ölçülmesine dayandırıldı. PCR ürünleriyle yapılan çalışmalar değerlendirildiğinde yöntemin klinik alanda uygulanabilirliği gözlendi. Çalışmanın ikinci bölümünde indikatörsüz DNA dizi algılama yöntemine yönelik elektrokimyasal DNA biyosensörü tasarlandı ve bu yöntemle ileri derecede boy kısalığı yapan ve tüm toplumlarda sıkça rastlanan bir iskelet displazisi hastalığı olan, 4numaralı kromozomun p kolunun 16.3 bölgesinde yer alan fibroblast büyüme faktörü reseptör 3 (FGFR3) geninin 1138. nükleotidinde yer alan guanin bazının adenin ve ya sitozine dönüşümü ile ortaya çıkan Akondroplazi G 380R mutasyonunun tayini yapıldı. Yöntem elektrot yüzeyine elektrostatik olarak bağlanan91 inozinli probun ve hibridizasyondan sonra diferansiyel puis voltametresiyle alınan Guanin sinyallerinin farklılanması esasına dayandırıldı. Guanin analoğu olan inozinli problar ile hiçbir elektrokimyasal yanıt alınmaz iken karşılığı olan hedef dizi ile, hedef dizinin sahip olduğu guaninler sayesinde 1.0 V da guanin sinyali alındı ancak, tek bazı farklı olan hedef ile hibridizasyondan sonra prob gibi hiçbir sinyal gözlenmedi. Bu da EVET/ HAYIR SİSTEMİ' nin esasını oluşturdu. Çalışma hem sentetik oligonükleotitler ile hem de hasta örneklerinden hazırlanmış PCR ürünleri ile gerçekleştirildi. Çalışmada iki tip prob kullanılmasıyla, tek nokta mutasyonunun tayini yanısıra heterozigot - homozigot ayırımı da yapıldı. Böylece tüm sonuçlar değerlendirildiğinde çalışmanın kliniğe uygulanabilirliği saptandı.

92 Abstract In this study, indicator-free and indicator based DNA detection methods are developed by using DNA biosensors. The applicability of these methods on detection of genetic and inherited diseases is showed by using real samples from patients. In the first part, the detection and discrimination of Herpes Simplex (HSV) type I and type II viruses, which have similar genomes but differ with infection regions on body, are performed by using indicator based DNA detection method and Meldola Blue (MDB) which intercalates into DNA double strand as a hybridization indicator. The detection and discrimination of these two types are studied with synthetic oligonucleotides and PCR real samples by using both of its probes. Probes are attached to the electrode surface covalently. The probe-modified electrode is hybridized with target synthetic oligonucleotides and PCR real samples. Hybrid, which has occurred on the electrode surface, is interacted with MDB and the differences on the MDB signals are measured with differential pulse voltammetry (DPV). In the second part, an electrochemical DNA biosensor based on indicator-free DNA detection method is designed. Achondroplasia G380R mutation which is occurred with a change of guanine base at the position of 1138 on fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR 3) gene to adenine or cytosine bases, is detected with this method. Method is based on the electrostatic immobilization of inosine-modified probe on the electrode surface and the detection of differences on guanine signals with DPV after hybridization. Inosine is an analog base for guanine and it has no signal at the potential of guanine. The advantage of this method is no signal is detected with inosine substitute probe but guanine signal at 1.0 V is detected after hybridization with target because of the guanine bases on target sequence. This is