Endotelin reseptör antagonizmasının tavşanlarda, erken ateroskleroz modelinde meydana gelen biyokimyasal parametreler, vasküler reaktivite ve damar morfometrisindeki değişiklikler üzerine olan etkisi

Abstract

6. ÖZET Endotelinin güçlü bir kemoatraktan ve mitojen olduğu bilinmektedir. Bu yönüyle endotelîn bir erken ateroskleroz modeli olarak kabul edilen yaka modeli ile oluşan intimal kalınlaşmanın patojenezine katkıda bulunabilir. Ayrıca düz kas hücre migrasyonunu ve proliferasyonu kolaylaştıran matriks metaloproteinaz enzimlerinin (MMP' ler) özellikle de ateroskleroz ile ilişiklendirilen jelatinaz grubu MMP' lerin (MMP-2 ve MMP- 9) ekspresyon ve aktivitelerini artırabilir. Endotelin (ET) reseptör antagonizması intimal kalınlaşmayı inhibe edebilir, vasküler reaktivite değişikliklerini etkileyebilir. Jelatinaz enzim ekspresyon ve aktîvitesini azaltabilir. Bu hipotezden hareketle çalışmamızda yaka modeli ile oluşan intimal kalınlaşma patojenezine endotelinin olası katkısının ve endotelin-jelatinaz enzimleri ilişkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Buna ek olarak çalışmamızda yeni bir ETA/ ETB reseptör antagonist olan TAK-044' ün bu modelde endotelin ve jelatinaz aktivitesi üzerine ve intimal kalınlaşma sürecine paralel olarak gelişen vasküler reaktivite değişiklikleri üzerine olan etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmamızda üç ayrı deney serisinde her iki cinsiyetten beyaz tavşanlar kullanılmıştır. Herbir deney serisi plasebo ve TAK-044 olmak üzere iki gruba ayrılmıştır. Bunlardan ilk deney serisinde histolojik analizler (morfometrik ve immünohistokimyasal incelemeler) ve vasküler reaktivite deneyleri yapılmış (n=20), ikinci deney serisinde ELISA yöntemi ile doku ve plazmada endotelin düzeyi ölçülmüştür (n=14). Üçüncü deney serisinde ise jelatin zimografi yöntemi ile jelatinaz enzim aktivitesi ve düzeyi (n=12) belirlenmiştir. Tedavi grubu s.k. yoldan 5mg/kg/gün dozunda TAK-044, plasebo grubu ise taşıyıcı olarak % 0.9 NaCI almıştır. TAK-044 ve plasebo uygulamasının 8. gününde tavşanların sol karotid arterlerinin çevresine sıkıştırıcı olmayan, inert bir silikon yaka yerleştirilmiştir. Sağ karotid artere ise yalancı operasyon uygulanmıştır. Operasyon sonrası tavşanlar iki hafta boyunca standart diyet ile beslenmişler ve 22. günde sakrifiye edilmişlerdir. Histolojik analizler,biyokimyasal analizler ve organ banyosu deneyleri için tavşanların her iki karotid arterleri izole ve disekte edilmiştir. Histolojik analizler için ayrılan dokular, parafin bloklara gömülmüş ve kesitlere ayrılmıştır. Daha sonra morfometrik incelemeler için hematoksilin-eosin ile immünohistokimyasal incelemeler için ise MMP-2, NIMP-9 ve Ki-67' ye özgü monoklonal antikorlarla boyanmıştır. Morfometri için kesitlerin lümen, intima ve medya alanları bir imaj analiz programı kullanılarak ölçülmüş, indeks değerleri ve lümen/medya oranları hesaplanmıştır. Kalınlaşmış intimadaki hücrelerin proliferatif aktivitesi Ki-67 monoklonal antikoru kullanılarak değerlendirilmiştir. Organ banyosu deneyleri için ayrılan dokular vasküler reaktivite çalışmalarında kullanılmıştır. Biyokimyasal analizler için ayrılan doku ve plazma örneklerinde ise ELISA yöntemi ile endotelin düzeyleri ve jelatin zimografî yöntemi ile jelatinaz enzim düzeyleri belirlenmiştir. Verilerin istatistiksel analizleri SPSS programının ANOVA modülü ve/veya nonparametrik testler (Wilcoxon signed rank test ve Mann Whitney U test) kullanılarak gerçekleştirilmiş ve p değeri<0.05 olduğunda anlamlı kabul edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± ortalamanın standart hatası (O ± O.S.H) olarak gösterilmiştir. Bu çalışmada morfometrik analiz bulgularına göre plasebo grubunda (n=9) intimal alan ve indeks yaka arterlerde kontrol arterlere kıyasla anlamlı düzeyde artmıştır (p<0.05). Tedavi grubunda (n=9) TAK-044, yaka uygulanan arterlerde kontrol arterlere göre intimal kalınlaşmayı anlamlı şekilde inhibe etmiştir (p<0.05). Plasebo grubunda luminal alan yakadan etkilenmemiştir. TAK-044 tedavisi her iki arter tipinde luminal alanı anlamlı şekilde artırmıştır (p<0.05). Çalışmamızın vasküler reaktivite bulgularına göre diğer çalışmalarla uyumlu olarak yaka yerleştirilmesi plasebo grubunda (n=10) serotonine karşı duyarlık artışı, potasyum klorüre karşı maksimum kontraktil cevabın azalması gibi yakanın neden olduğu tipik vasküler reaktivite değişikliklerine sebep olmuştur. LNA ile NO sentez inhibisyonu kontraktil ajanlara yanıtları artırmıştır. TAK-044 tedavisi (n=10) vasküler reaktivitede belirgin bir etki oluşturmamıştır. Jelatinaz enzim ekspresyonunun immünohistokimyasal olarak değerlendirilmesine göre plasebo grubunda (n=10) MMP-2 ekspresyonu yaka etkisiyle anlamlı düzeyde artmış (p<0.05), TAK-044 tedavisi (n=10)158 ise bu artışı güçlü bir şekilde inhibe etmiştir (p<0.001). MMP-9 ekspresyonu ise yaka ve TAK-044 uygulamasından etkilenmemiştir. Diğer yandan jelatin zimografi sonuçlarının değerlendirilmesine göre plasebo grubunda (n=4-5) her iki jelatinaz enzim aktivitesi yaka etkisi ile artmış, TAK-044 (n=4-5) ise her iki enzim aktivitesini anlamlı düzeyde inhibe etmiştir (MMP-2 için p<0.01, MMP-9 için p<0.05 plasebo-TAK-044 arasında). ELISA analizlerine göre plasebo grubunda (n=7) damar dokusunda ET düzeyi yaka etkisiyle anlamlı şekilde artmış (p<0.05), TAK-044 tedavisi ET düzeylerini etkilememiştir. Kan basıncı yaka uygulaması ve TAK-044 tedavisinden etkilenmemiştir. Sonuç olarak yaka modeli ile oluşan intimal kalınlaşmanın patojenezine ET katkı sağlamakta ve ET bunu kısmen jelatinaz enzimlerini aktive ederek gerçekleştirmekte gibi gözükmektedir. ETA/ETB reseptör antagonist TAK-044, bu modelde intimal kalınlaşma gelişimini inhibe etmiş ve arterlerin lümen alanlarını artırmıştır. Ayrıca jelatinaz enzim aktivitesi ve düzeyini azaltmıştır. Bununla beraber yaka ile oluşan vasküler reaktivite değişikliklerini etkiliyor gibi gözükmemektedir.

159 7- ABSTRACT Endothelin, which is known to be a strong chemoatractant and mitogen, may possibly contribute to the pathogenesis of collar-induced intimal thickening which is accepted as an early model of atherosclerosis. In addition, endothelin has been shown to play a role in the increasing expression and activity of matrix metalloproteinases (MMPs), in particular gelatinases (MMP-2 and MMP-9). Furthermore, it is known that MMP expression is associated with smooth muscle cell proliferation and migration. However, the possible role of endothelin and endothelin antagonism has not yet been assessed in the collar model. In this study, we aimed to investigate the possible role of endothelin and endothelin antagonism in the development of intimal thickening and vascular reactivity changes in the collar model. In addition, the purpose of our study was to determine the effects of endothelin antagonism on MMP-2 and MMP-9 activities and the possible interaction between endothelin and these two enzymes. White rabbits of either sex (2-2.5 kg) were used in three different experiment sets. Each set was divided into two groups. Treatment group received a single s.c. injection of TAK-044 (5 mg/kg per day). The placebo group received only the vehicle (0.9% NaCI 0.8 ml/kg per day). In the first experiment set (n=20), the morphometric, immunohistochemical analyses and vascular reactivity studies were performed. In the second set (n=14) arterial tissue and plasma endothelin levels were measured. Gelatinase enzyme activities were determined in the third experiment set (n=12). In all experiment sets, on the 8th day of either placebo (0.9% NaCI) or drug treatment (TAK-044), rabbits were anaesthetized with intravenous sodium pentobarbital (30 mg/kg) application. Subsequently, the left carotid artery was surgically accessed and a non-occlusive, flexible silicone collar (2 cm in length) was placed around it. The right carotid artery was sham-operated. The carotid arteries were then160 replaced in their original positions and incisions were closed by suturation. After recovery from the anesthesia, the animals were kept in their individual cages for a further 2 weeks before tissue isolation. On the 22nd day, IV heparin (150 units/kg) was administered to the rabbits for anticoagulation. Then the rabbits were sacrificed by overdose of sodium pentobarbital. Sham-operated and collared arteries were isolated and dissected. In the first experiment set, sham and collared arteries were dissected into two pairs of rings (4 mm in length), of which one pair was used for morphometry and the other was used for organ-chamber experiments. The first pair of rings was immediately placed in formalin fixative solution (4%) before being embedded in paraffin. Transverse sections were cut and stained with sirius red haematoxylin. Areas of lumen, intima and media were measured at three cross sectional levels using a computer assisted image analyzer system consisting of a microscope and video camera. The second pair of rings was suspended in organ chambers filled with physiological salt solution (Krebs) at 37°C, continuously oxygenated. In order to examine the effects of the inhibition of nitric oxide synthesis on contractile activities of the rings, LNA (10`4 M) was added to Krebs solution (one ring with LNA, one ring without LNA). Isometric contractile force development was measured by means of a transducer and recorded by means of a computer. In the second experiment set, the arterial tissues and plasma samples from both groups were used to measure endothelin levels using an ELISA kit. In the third experiment set, gelatinase activities of arterial tissues from both groups were determined by zymography. Statistical analyses of data were performed by factorial analysis of variance (ANOVA). If there were interactions between the factors in ANOVA, Wilcoxon signed ranks test and Mann-Whitney U-test were used for paired and unpaired comparisons. Data are shown as means ±S.E.M. n indicates the number of animals. Significance was accepted at p=0.05.161 In this study, morphometric studies revealed that intimal cross- sectional area and the ratio of intimal area to medial area (index) were significantly increased in collared arteries as compared to those in sham-operated arteries in placebo group (n=9, p<0.05). TAK-044 treatment significantly inhibited the intimal thickening and also significantly decreased the index (n=9, p<0.05). The luminal cross- sectional area and luminal area to medial area ratio were not affected by the collar. TAK-044 treatment significantly increased luminal area and luminal area to medial area ratio (n=9, p<0.05). In terms of vascular reactivity studies (n=10); collar placing induced typical vascular reactivity changes, such as increased sensitivity to serotonin (n=7, p<0.01) and reduced sensitivity to acetylcholine (n=7, p<0.05). LNA incubation increased maximum contractile forces and sensitivity to 5-HT (n=7, p<0.01) and phenylephrine (n=6, p<0.01). On the other hand, TAK-044 treatment did not affect the collar and LNA induced modifications, despite the significant reduction of intimal thickening. As seen in zymograms, with regard to the role of gelatinases in the collar model, it has been shown that collar increased the activities of these enzymes (n=4 or 5). TAK-044, an endothelin receptor antagonist, decreased gelatinase enzyme activities in collared arteries as compared to those of placebo group (n=4 or 5, p<0.01 and p<0.05, respectively). Endothelin (1-21) levels were measured in sham-operated and collared arteries from both groups (n=7). The collar significantly increased the endothelin levels in collared arteries from both groups (p<0.05). TAK-044 did not significantly affect these increased levels of endothelin in either sham-operated or collared arteries. In conclusion, our study clearly demonstrated that endothelin plays a role in the formation of intimal thickening in the collar model. In addition, TAK-044 inhibits the formation of intimal thickening without altering endothelin levels of the arterial tissues. However, TAK-044 did not affect collar-induced vascular reactivity changes in this model. Moreover, gelatinases (MMP-2 and MMP-9) have been shown to play a role in the collar model. TAK-044, which is an endothelin receptor antagonist, decreased pro-MMP-2 levels in collared arteries as compared162 to those of placebo group. Furthermore, treatment with TAK-044 significantly reduced MMP-2 and MMP-9 activities in collared arteries.