Fasciola hepatica cathepsin L1 geninin ökaryotik hücrelerde açıklatılması

Abstract

1. ÖZET Fasciola hepatica sıklıkla sığır ve koyunlarda nadiren de insanlarda fasciolosise neden olan bir karaciğer trematodudur. Fasciolosis dünyada ve ülkemizde yaygın olarak bulunmakta ve özellikle hayvancılık sektöründe önemli ekonomik kayıplara yol açmaktadır. F. hepatica'nm ES antijenlerinden olan Cathepsin Ll parazitin dokulara penetrasyonda, immun yanıttan kaçmasında ve beslenmesinde önemli rolü olan bir enzimdir. Özgül antijenik yapısı nedeniyle tanı yöntemlerinde ve korunma amacıyla immünizasyon çalışmalarında kullanılabilecek potansiyel bir moleküldür. Bu çalışmada F. hepatica cathepsin Ll geninin klonlanması ve ökaryotik hücrelerde açıklatılması amaçlanmıştır. Bu amaçla erişkin F. hepatica'dan toplam RNA izolasyonu yapılarak tersine transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (TT-PZR) ile cathepsin Ll DNA amplikonları oluşturuldu. Cathepsin Ll genine özgü primerler kullanılarak 981 bazlık cathepsin Ll geni kodlama bölgesi çoğaltıldı. Daha sonra, cathepsin Ll geni pCI-neo açıklama vektörüne klonlanarak PZR-T ve enzim kesim deneyleri ile genin varlığı doğrulandı. Oluşturulan rekombinant plazmit, pFhCLl olarak adlandırıldı. Rekombinant pFhCLl plazmiti Vero hücrelerine geçici olarak transfekte edilerek cathepsin Ll proteinin varlığı Vestern immunoblotlama ile gösterildi. Anahtar kelimler: F. hepatica, cathepsin Ll, klonlama, protein açıklatılması

2. ABSTRACT The parasitic trematode Fasciola hepatica is the causative agent of fasciolosis that is common in ruminants especially sheep and cattle occasionally human. Fasciolosis is a worldwide distribution including Turkey and causes major economic losses in agriculturel industry. Cathepsin LI is one of the major molecules in the excrotory-secretory products of F. hepatica and is involved tissue penetration, immune evasion and feeding therefore may be used in vaccination and serological diagnosis. The aim of this study was to evaluate cloning and expression of cathepsin LI gene of F. hepatica eucaryotic cells. For this purpose, total RNA was extracted from adult F. hepatica. Cathepsin LI DNA amplicons were obtained with reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). 981 bases cathepsin LI coding gene region was amplified by using spesific primers to the cathepsin LI gene. Then, the cathepsin LI gene was cloned into pCI-neo mammalian expression vector. The presence of cathepsin LI gene was confirmed by PCR screening and enzyme digestion assays. So, the resulting recombinant plasmid was named as pFhCLl. Afterwards, the pFhCLl vector was transiently tranfected into Vero cells. The presence of the cathepsin LI proteins was showed by Western Immunoblotting. Key words: F. hepatica, cathepsin LI, cloning, protein expression.