Farmasötik analiz için HPLC`den UPLC`ye analitik yöntem transferi

Abstract

Ultra performanslı sıvı kromatografisi (UPLC), yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC)?ne kıyasla göreceli olarak sağladığı daha düşük tayin ve belirleme sınırları, yüksek tekrarlanabilirlik, kısa analiz süresi, sarf malzemesi tasarrufu, daha az tehlikeli atık miktarı gibi sağladığı yararlar nedeniyle son yıllarda hızla HPLC?nin yerini almaktadır. Mevcut durumda sıklıkla sorunla karşılaşılan süreç geçerli (valide) HPLC yöntemlerinin UPLC?ye adaptasyonu aşamasıdır. Tez çalışmamızda her iki cihaz arasında yöntem transferi ve adaptasyonunun, hızlı, az sorunlu ve olabildiğince az deney yapılarak gerçekleşebilmesi için, tamamıyla analitik verilere dayalı, bir transfer çalışmasının yapılması amaçlanmıştır. HPLC ile ilaç etkin maddelerinin miktar tayinleri standart analitik LC yöntemlerin kullanımıyla 1970?li yıllardan beri yapılmakta ancak çalışma sayısı UPLC?nin kullanıma girmesiyle son yıllarda hızlı bir azalma göstermektedir. Benzer analizlerin UPLC ile yapılmasının çok sayıda faydası olmakla birlikte analitik yöntemin UPLC donanımı kullanılarak çalışılacak olması nedeniyle yeniden deneysel olarak oluşturulması, sınanması ve geçerlilik (validasyon) testlerinin yapılması gibi başlıca sakıncaları da bulunmaktadır. Tez konusunun nihai ana hedefi model olarak seçilen iki adet ilaç etkin maddesi (fenilefrin hidroklorür ve parasetamol) için HPLC?de geliştirilen 2 farklı yöntemin (MF1 ve MF2 mobil fazlarını kullanan) UPLC?ye transfer edilmesidir. Bu amaçla kolon boyutları, mobil faz ve dedektör özellikleri, akış hızı, loop hacmi, analiz zamanı vb değişkenler ile çalışılarak kromatogramlara etkileri saptanmaya çalışılmıştır. MF1 olarak %75-25 (h/h) MeOH-50mM PBS (pH 6,0), MF2 olarak ise %30-70 Ach-50mM PBS (pH 4,0) ile çalışılmıştır. MF1 mobil fazıyla izokratik koşullarda C18 tabanlı dolgu maddesine sahip ve boyutları 250mmx4.6mm, 5µm partikül çapı ve 80Å por çapına sahip bir HPLC kolonu 20µL loop hacmi ve 1.0mL/dakika?lık akış hızıyla kullanılarak elde edilen optimum bir HPLC kromatogramını aynı ayırım gücüyle ve aynı mobil fazla (MF1) UPLC?ye transfer etmek için kullanılması gereken aynı dolgu maddesine sahip analitik kolonun boyutları 50mmx2.1mm, 1.7µm partikül çapı ve 100Å por çapı olmalı ve analiz 10µL loop hacmi ve 300µL/dakika?lık akış hızıyla yürütülmelidir. Tez çalışmalarımız esnasında çalışılan diğer mobil faz olan (MF2) %30-70 (h/h) Ach-50mM PBS (pH=4.0) mobil fazıyla da izokratik koşullarda aynı aynı sonuçlara ulaşılarak yöntem transferi gerçekleştirilmiştir.

Ultraperformance liquid chromatography (UPLC) because of the advantages it has in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC), such as lower detection and quantification limits, higher reproducibility, shorter run time, savings in consumables, decreased amount of hazardous waste, is replacing HPLC in the recent years. In the current status the most problematic process is the adaptation stage of the valid HPLC methods to UPLC. In our thesis study, to perform a transfer work which is completely based on analytical data is aimed to perform the transfer and adaptation of method between both instruments in a fast and less problematic way which requires fewer practical experiments. Quantification of drug substances with HPLC is being perofrmed since 1970s with the use of standard LC methods but with the UPLC enterin service the number of works is rapidly decreasing in the last decade. Eventhough performing similar analysis with UPLC has various major advantages, it also has some leading disadvantages such as the need of the development, test and validation of the same HPLC method on UPLC, as the method will be used operating the UPLC hardware. The final major aim of the thesis subject is the transfer of two different methods of HPLC analysis (using MF1 and MF2 mobile phases) of two model drug substances (phenylephrine hydrochloride and paracetamol) to UPLC. For this purpose, variables such as column sizes, properties of mobile phases and detectors, flow rate, loop volume and analysis run time are studied to determine their effects on chromatograms. As MF1 75-25% (v/v) MeOH-50mM PBS (pH 6.0) and as MF2 30-70% Ach-50mM PBS (pH 4.0) were used. To transfer an optimum HPLC chromatogram obtained with MF1 mobile phase in isocratic conditions with an C18 analytical column of 250mmx4.6mm, 5µm particule size and 80Å pore size, with a 20µL loop volume at a flow rate of 1.0 mL/minute to UPLC with the same resolution in the same MF1 mobile phase, the C18 column needed has to have the sizes 50mmx2.1mm, 1.7µm particule size and 100Å pore size and the analysis should be performed at 10µL loop volume and 300µL/minute flow rate. Similar results were repeated again in isocratic conditions with 30-70% (v/v) Ach-50mM PBS (pH=4.0) which was the other mobile phase studied in the thesis (MF2).