Dermal uygulama amacıyla DNA taşıyıcı sistemlerin hazırlanması

Abstract

Tez çalışmamızın amacı dermal uygulamaya uygun özelliklere sahip DNA taşıyıcı sistemler geliştirerek, karakterizasyonlarını yapmak; optimal olarak seçilen formülasyonların transfeksiyon etkinliklerini ve dermal uygulanabilirliklerini saptamaktır.Ön formülasyon denemelerinde mikroemülsiyon formülasyonu için Labrafac PG, Labrafac Lipophile ve Peceol yağları ile Plurol Oleique CC, Lauraglycol FCC, Lauraglycol 90, Capryol PGMC, Labrafil M sürfaktan olarak kullanılmıştır. Katı lipit nanopartikül formülasyonu için yağ olarak Precirol ATO 5, katyonik özellik kazandırmak için Esterquat-1, CTAB, DDAB katyonik maddeleri ile çalışılmıştır. Faz diyagramları oluşturulduktan sonra, berrak sistemler oluşturan formülasyonlar seçilerek karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. Mikroemülsiyon formülasyonlarında damlacık boyutu, KLN (Katı Lipit Nanopartikül)'lerde partikül boyutu 100 nm'nin altında olan formülasyonlar seçilerek, salım çalışmaları ve hücre kültüründe transfeksiyon gerçekleştirilmiştir. Mikroemülsiyon formülasyonu için katyonik madde olarak kitozan seçilmiştir. Kitozan, doğal bir biyopolimer olması, toksik olmaması nedeniyle ve deriye kolayca adsorbe olabilme yeteneğinden dolayı tercih edilmiştir. Oluşturulan mikroemülsiyonun iç sulu fazına kitozan eklenerek karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. KLN formülasyonu için EQ1(Esterquat-1) en uygun katyonik madde olarak saptanmıştır. Mikroemülsiyon formülasyonuyla S/Y türünde olduğu, yüksek oranda yağ içerdiği için jel görüntülemesi gerektiren denemeler gerçekleştirilememiştir. KLNeq (EQ1 içeren KLN formülasyonu) formülasyonu için karakterizasyon çalışmalarının ardından SDS teşvikli DNA salım çalışması yapılarak, formülasyonun DNA'yı salma etkinliği test edilmiştir. Daha sonra DNazI koruma çalışmasıyla formülasyonun DNA'yı nükleaz parçalamasından koruyup korumadığı araştırılmıştır. Deneylerin sonucunda KLNeq formülasyonun DNA'yı hem koruduğu, hem de SDS'e maruz kaldığında salabildiği belirlenmiştir. Bu denemelerde optimal kompleksleşme oranı DNA:KLN 1:1 (h/h) olarak saptanmıştır. İn vitro salım çalışmalarıyla KLNeq formülasyonun selüloz membrandan geçişi araştırılmıştır. Franz difüzyon hücreleriyle yapılan bu denemede reseptör kompartmandan alınan örneklerde ilk yarım saat sonucunda 5 µg/mL konsantrasyonunda DNA saptanmıştır. 24 saatlik denemenin ardından 0,5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 24. saatlerde alınan örnekler liyofilize edilerek 10 kat konsantre hale getirildikten sonra DNA konsantrasyonları tekrar ölçülmüştür. Bu ölçümlerde ilk yarım saat için DNA konsantrasyonu 18,1 µg/mL bulunmuştur. L929 fare fibroblast hücre kültürü çalışmalarıyla formülasyonların toksisitesi araştırılmış, toksik olan dozlar belirlenmiştir. KLNct (CTAB içeren KLN formülasyonu) formülasyonunun uygulanan tüm dozlarında formülasyonun toksik olduğu saptanmış, KLNeq ve ME (Mikroemülsiyon) formülasyonlarında uygulanan dozlar içinde 5 µL doz uygun kabul edilmiştir. Toksik olmayan formülasyonlar hücre kültürüne uygulandıktan sonra floresan mikroskopta görüntüleri alınmıştır. pEGFP-C1 plazmit DNA'nın hücrelere aktarıldığı, yeşil floresans proteinin varlığının gözlenmesiyle belirlenmiştir. KLNeq ve KLNeq.DNA (EQ1 içeren ve DNA ile kompleksleştirilmiş KLN formülasyonu) formülasyonlarının TEM (Transmisyon Elektron Mikroskobu) görüntülemeleri yapılmıştır, ancak ME ve ME.DNA (DNA içeren Mikroemülsiyon formülasyonu) formülasyonları yüksek yağ içerikleri sebebiyle görüntülenememiştir. KLNeq formülasyonunun stabilitesi 2 ay boyunca takip edilmiştir. Bu süre boyunca partikül boyutu, PDI ve zeta potansiyel ölçümleri alınmıştır. ME formülasyonu da aynı süre zarfında görsel olarak izlenmiş ve yapısında hiçbir değişme görülmemiştir. Sonuç olarak, geliştirilen küçük partikül boyutuna sahip ME.DNA ve KLNeq.DNA sistemler, gen tedavisi amacıyka transdermal uygulamalar için önerilebilir.

The aim of this study was to develop and characterize DNA delivery systems suitable for dermal applications, and to determine transfection efficiacy of optimal formulations. In pre-formulation studies Labrafac PG, Labrafac Lipophile and Peceol were used as oils, Plurol Oleique CC, Lauraglycol FCC, Lauraglycol 90, Capryol PGMC, Labrafil M were used as surfactants for microemulsion formulation. Precirol ATO 5 was used as oil for solid lipid nanoparticle formulation, Esterquat-1, CTAB and DDAB as cationic materials used for gaining cationic specialities. Transparent formulations were selected for characterization studies after forming ternary phase diagrams. Formulations which have droplet and particle sizes below 100 nm were selected for further experiments such as in vitro release and transfection studies.Chitosan was selected as cationic substance for microemulsion formulation because of it's ability to easily adsorb to the skin and it's non-toxic natural biopolymer character. Characterization studies were carried out after adding chitosan to internal water phase of microemulsions. Esterquat1 was the most suitable cationic material for solid lipid nanoparticle formulation. Experiments that requiring gel imaging could not be carried out for microemulsion formulation because of it's type (w/o) and high oil content. DNA release capacity of KLNeq.DNA formulation was examined with SDS-induced release study after its characterization studies. Then, protection from nuclease degredation was investigated with DNaseI protection study. As the result of all studies, release of DNA from KLNeq.DNA complexes in the presence of SDS and protection against DNaseI were proven. Optimal complexation ratio of DNA:KLN was determined as 1:1 (v/v).In vitro release of DNA from KLNeq.DNA system through cellulose membrane was investigated. 5 µg/mL DNA was found in the samples that was taken from receptor compartment at the 30th minute from the beginning of Franz diffusion cell trials. Release study was repeated with 10 fold concentrated samples, and then in 30th minute 18,1 µg/mL DNA concentration was determined.Toxicity of formulations was investigated on L929 mouse fibroblasts cells. All applied doses of the KLNct formulation were found toxic. 5 µL dosage of KLNeq.DNA and ME.DNA was found non-toxic and applicable. Fluorescent images of non-toxic formulations taken after applying cell culture study. Transfection of pEGFP-C1 plasmid DNA to cells were determined by observing the presence of green fluorescent protein. TEM imaging of KLNeq and KLNeq.DNA formulations were carried out, but because of microemulsions high oil content, their TEM images could not be obtained. Stability of KLNeq formulation was observed for 2 months by measuring particle size, PDI and zeta potential values. Microemulsion formulation was visually monitored at the same time and no changes were determined. As the result, developed ME.DNA and KLNeq.DNA sytems with particle sizes below 100 nm may be suggested for transdermal gene therapy applications.