Elektrokimyasal yöntem ve mikrozomal fraksiyon aracılıklı ilaç metabolitleri üretimi ve enzimatik karakterizasyonu

Abstract

Bu tez kapsamında ileri çalışmalarda referans olarak kullanılabilecek ilaç metaboliti üretme yöntemi olarak, seçilmiş olan model ilaçlara elektrokimyasal oksidasyon yöntemi uygulanmıştır. Elektrokimyasal yolla üretilen bu oksidasyon ürünlerinin biyolojik uygunluklarını araştırmak amacıyla aynı ilaç molekülleri gerekli kofaktörler ve karaciğer mikrozomları ile eşzamanlı olarak inkübe edilmiştir. Elektrokimyasal yöntem olarak denenen döngüsel voltametri yöntemi ve çevrim-içi elektrokimyasal yöntemden ikincisinin daha fazla miktarda metabolit oluşturduğu görülmüş ve çalışmalara bu yöntemle devam edilmiştir. Model ilaç molekülü olarak seçilen parasetamolün reaktif metaboliti N-asetil-p-benzokinonimin (NAPQI) üretimi için optimum koşullar belirlenmiştir. Diğer iki model ilaç molekülü olan olanzapin ve klozapin aynı şekilde elektrokimyasal yöntemle okside edilmiş, her iki molekülün hem reaktif metabolitleri, hem de stabil metabolitleri elde edilmiştir. Literatürde daha önce tanımlanmış olan bu metabolitler karaciğer mikrozomları ile de oluşturularak biyolojik uygunlukları doğrulanmıştır. Sitokrom P450 (CYP450) aktivitesi için gerekli redükleyici kofaktör NADPH inkübasyon ortamına konmadığında oluşan metabolit miktarının çok az olmasıyla söz konusu reaksiyonları CYP450 enzimlerinin katalize ettiği gösterilmiştir. Maddelerin HPLC-UV analizlerini takiben kimyasal yapı doğrulama için LC-MS/MS tekniğine dayalı selected reaction monitoring (SRM) yöntemleri kurulmuş ve tez sonrası dönemde söz konusu ilaçları kullanan hastalarda planlanan klinik çalışmalar için hazırlıklar tamamlanmıştır. Anahtar kelimeler: ilaç biyotransformasyonu; elektrokimyasal oksidasyon;mikrozomal inkübasyon; parasetamol; klozapin; olanzapin

In this thesis, electrochemical oxidation method was applied to model drugs in order to generate their metabolites as reference compounds for further studies. Simultaneously, biological relevancy of electrochemically generated metabolites were checked by incubating the same parent molecule with liver microsomes in the presence of required cofactors. It has been observed that the on-line electrochemical method generated more metabolites compared to cyclic voltametric method. Therefore the former was used throughout the studies. The optimum conditions for generating N-acetyl-p-benzoquinonimine (NAPQI), the reactive metabolite of paracetamol, were determined. The other two model drugs, olanzapine and clozapine were oxidized similarly, and both reactive and stable metabolites were obtained from both molecules. These previously identified metabolites were generated also by liver microsomes, and their biological relevancy was confirmed. The observation of dramatically diminished amount of metabolites when NADPH, the reducing factor for cytochrome P450 (CYP450) was omitted from incubation medium showed CYP450-dependency of formation of the metabolites. Following products' analyses by HPLC-UV technique, selected reaction monitoring (SRM) methods with LC-MS/MS were optimized and preparations were done for further clinical studies in post-thesis period, which were planned in patients medicated with these drugs. Key words: Drug biotransformation; electrochemical oxidation; microsomal incubation; paracetamol; clozapine; olanzapine