Lizozim, laktoferrin ve taşıyıcı olarak poloksamer 407 içeren yeni formulasyonların biyouyumluluklarının in vitro koşullarda değerlendirilmesi

Abstract

Üç yaşın altındaki çocuklarda, gelişmekte olan sürekli dişlerde fluorozis riskioluşturması nedeniyle fluoridli diş macunu ve uzun süre kullanımındaki yan etkileri vesitotoksisitesi nedeniyle klorheksidinin kullanımı önerilmemektedir. Tükürükproteinlerinden Lizozim ve Laktoferrin içeren bir preparatın küçük çocuklarda dişçürüklerinin önlenmesi için bir çözüm getirebileceği düşünülmüş, poloksamer taşıyıcısistemler kullanılarak geliştirilen yeni bir formulasyonun topikal uygulamalarının ağızhastalıklarının tedavisinde etkili olduğu görülmüştür.Bu nedenle, Lizozim, Laktoferrin ve taşıyıcı sistem olarak Pluronic F-127 isimliPoloksamer kullanılan, diş çürüğüne neden olduğu bilinen Streptococcus sobrinus,Streptococcus mutans ve Lactobacillus acidophilus bakteri suşları üzerindekiantibakteriyel etkileri kanıtlanmış farklı formulasyonlar geliştirilmiştir. Bu çalışmanınamacı, yeni geliştirilmiş bu formulasyonların biyouyumluluklarının klorheksidin jel ilekarşılaştırmalı olarak in vitro koşullarda değerlendirilmesidir.Çalışmamızda kullanılan formulasyonlar: (1) pH:5.0 Sorensen's TamponÇözeltisi, (2) %20 a/h Poloksamer 407 jel, (3) %10 a/h Poloksamer 407 jel, (4) Lizozimve Laktoferrinin %20 konsantrasyondaki poloksamer 407 ile birleştirilmesiyle, (5) 4.grubun MİK değeri olacak şekilde Lizozim ve Laktoferrinin %10 konsantrasyondakipoloksamer 407 ile birleştirilmesiyle, (6) Sorensen's Çözeltisi (pH:7.0) negatif kontrololarak, (7) Lizozim ve Laktoferrin tamponda (Sorensen's Çözeltisi pH:5.0)çözdürülerek yedi grup olarak hazırlanmıştır. Kontrol grubu olarak % 0.2'likklorheksidin gargara kullanılmıştır. Mukozal membran iritasyonunun değerlendirildiğibirinci bölümde, HET-CAM yöntemi kullanılarak tavuk embriyosu içeren yumurtalarüzerinde formulasyonların iritasyon skorları belirlenmiştir. İkinci bölümde ise, MTTtest yöntemi kullanılarak formulasyonların L 929 hücre kültürü üzerine sitotoksiketkileri değerlendirilmiştir.Mukozal iritasyon testi iki farklı deney şeklinde yürütülmüş, her iki deneyde degruplar zayıf ve orta derecede iritasyon göstermiş, grupların hiç birinde mukoza üzerineIIIciddi derecede iritasyon gözlenmemiştir. Kontrol grubu olan klorheksidin gargaranıniritasyon seviyesi ile diğer gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farkarastlanmamıştır.Sitotoksisite deneyinde ise, klorheksidin gargara en düşük hücre canlılıkoranlarının görüldüğü grup olarak saptanmıştır. pH değeri 7.0 olan Sorensen's Çözeltisien düşük sitotoksisite değerlerini gösteren, biyouyumluluk seviyesi en yüksek grupolarak belirlenirken, diğer gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farkarastlanmamıştır.Bu çalışmada, deney gruplarından hiç biri ciddi derecede sitotoksisite veyamukozal iritasyon göstermemiştir. Ancak, maddelerin daha uzun süreli etkilerininanlaşılabilmesi için, ileriki çalışmalarda bu maddelerin etkinliğinin kinetik olarakdeğerlendirilmesi ve hayvan deneylerinin yapılması gerektiği düşünülmektedir.Anahtar Kelimeler: Lizozim, Laktoferrin, Poloksamer 407, HET-CAM, sitotoksisite

In children that under three years old are not suggested to use fluoridatedtoothpaste because of the risk of fluorosis in developing permanent teeth orchlorhexidine for a long period resulting adverse effects and cytotoxicity. Newformulations containing saliva proteins such as lysozyme and lactoferrin might beeffective on preventing tooth decay in younger children. Topical application ofantimicrobial agents with the drug delivery system poloxamer is thought to be effectivein the treatment of oral diseases.Therefore, formulations containing lysozyme, lactoferrin and drug deliverysystem poloxamer 407 with the trade name of Pluronic F-127 were produced and it hasbeen proven that these formulations are effective on cariogenic bacteria such asStreptococcus sobrinus, Streptococcus mutans and Lactobacillus acidophilus. The aimof this study was to determine the biocompatibility of these new formulations incomparison with 0.2 % chlorhexidine in vitro conditions.Formulations for our study were prepared and divided into seven differentgroups as follows: (1) Sorensen's solution (pH: 5.0) as buffer, (2) %20 gel formulationcontaining only poloxamer 407, (3) %10 gel formulation containing only poloxamer407, (4) Lysozyme and Lactoferrin with %20 concentration of poloxamer 407, (5)Lysozyme and Lactoferrin with %10 concentration of poloxamer 407 as MIC value ofgroup 4, (6) Sorensen's Solution (pH:7.0) as negative control group and (7) dissolvedLysozyme and Lactoferrin in buffer (Sorensen's Solution pH:5.0). %0.2 chlorhexidinemouthwash was used as the control group. In mucosal irritation study, irritation levelsof formulations were identified using HET-CAM test method on eggs containingchicken embriyos. In the cytotoxicity test, the MTT test method was used on L 929 cellculture in order to access the cytotoxic effects of the formulations.Mucosal irritation test was performed as two different experiments. Both testgroups showed low and moderate irritation levels, none of them showed seriousirritation levels. There was no statistical significance between the chlorhexidine controlgroup and other groups.The cytotoxicitiy experiment (MTT), chlorhexidine mouthwash showed lowestcell viability rates. Sorensen's Solution pH:7.0 group showed lowest cytotoxicitiy andhighest biocompatibility levels. There is no statistical significance between othergroups.In this study, none of the experimental groups showed severe cytotoxicitiy ormucosal irritation. However, more in vitro studies should be carried out to test thesematerials' kinetic efficiency and also animal studies should be conducted.Keywords: Lysozyme, Lactoferrin, Poloxamer 407, HET-CAM, cytotoxicitiy