Isolation of cytotoxic compounds from Glycyrrhiza glabra and G. iconica and investigation of their mechanisms of action

Abstract

Glycyrrhiza L. (meyan) türleri, çeşitli farmakolojik aktivitelerinden dolayı dünya çapında en yaygın kullanılan bitkilerden biridir. Son yıllarda, meyandan elde edilen sekonder metabolitler, özellikle önemli sitotoksik ve antitümör etkileri nedeniyle ilgi çekmektedir. Bu çalışma ile G. glabra L. ve G. iconica Hub.-Mor. türlerinin köklerinden biyoaktivite rehberli fraksiyonlama tekniği kullanılarak sitotoksik etkili sekonder metabolitlerin eldesi ve etki mekanizmalarının aydınlatılması amaçlanmıştır. G. glabra (IC50 = 18.9 - 33.6 μg/mL) ve G. iconica (IC50 = 4.3 - 12.7 μg/mL)'dan elde edilen ham MeOH ekstreleri hepatosellüler (Huh7), meme (MCF7) ve kolorektal (HCT116) kanser hücre serilerine karşı önemli derecede sitotoksisite göstermiştir. G. glabra (CHCl3 ve EtOAc) ve G. iconica (CHCl3, EtOAc ve n-BuOH)'ya ait aktif alt ekstratların çeşitli kromatografik ayırımları sonucu biri yeni (iconichalcone (1)) olmak üzere 28 farklı sekonder metabolit elde edilmiştir. G. glabra'dan izole edilen tetrahydoxymethoxychalcone (2), 4′-O-methylglabridin (16) ve glabrene (20) ile G. iconica'dan izole edilen 2, licoricidin (18), dehydroglyasperin C (21), iconisoflaven (22) ve 1-methoxyficifolinol (27) gerçek zamanlı sitotoksisite deneyi (RT-CES) sonuçlarına göre en güçlü bileşikler olarak belirlenmiş ve bu moleküllerin sebep olduğu hücre ölümünün moleküler mekanizmasının aydınlatılması amacıyla Huh7 hücrelerinde Hoechst boyaması, hücre döngüsü (FACS) ve Western blot deneyleri yapılmıştır. 2, 16, 18, 20, 21, 22 ve 27 numaralı bileşikler karaciğer kanser hücrelerinde kaspaz aktivasyonu ile apoptozu indüklemiş ve apoptotik subG1 fazında hücre artışına sebep olurken, hücre döngüsünü G1 ve/veya G2/M fazlarında durdurmuştur. Bunun yanısıra, 21 tümör supresör geni p53'ü aktive etmiştir; 2 ise Hoechst boyaması deneyinde yoğunlaşmış çekirdekler göstererek Huh7 kanser hücrelerinin apoptoz yoluyla ölümüne neden olmuştur. Dolayısıyla, ilgili bileşikler özellikle 2 ve 21 ümit vaat eden sonuçlar göstermiş olup, bu bileşiklerin daha ileri in vivo ve klinik deneyler ile de araştırılmayı hak eden, özellikle hepatosellüler kansere karşı antikanser ilaç gelişimi için potansiyel öncü moleküller olabilecekleri görülmüştür.

Glycyrrhiza L. (licorice) species are one of the most widely used plants worldwide for their various pharmacological activities. In recent years, secondary metabolites of licorice are gaining much attention especially due to their significant cytotoxic and antitumor effects. The aim of this study was to isolate the potential cytotoxic secondary metabolites from roots of G. glabra L. and G. iconica Hub.-Mor. through bioactivity-guided fractionation procedure and to elucidate their mechanisms of action. The crude MeOH extracts of G. glabra (IC50 = 18.9 - 33.6 μg/mL) and G. iconica (IC50 = 4.3 - 12.7 μg/mL) remarkably inhibited cell proliferation in hepatocelullar (Huh7), breast (MCF7) and colorectal (HCT116) cancer cell lines. Chromatographic separations conducted on the active subextracts of G. glabra (CHCl3 and EtOAc) and G. iconica (CHCl3, EtOAc and n-BuOH) yielded 28 different secondary metabolites including a new α,β-dihydroxychalcone, namely iconichalcone (1). The underlying mechanisms of the most active isolates tetrahydoxymethoxychalcone (2), 4′-O-methylglabridin (16) and glabrene (20) from G. glabra and 2, licoricidin (18), dehydroglyasperin C (21), iconisoflaven (22) and 1-methoxyficifolinol (27) from G. iconica with regard to real time-bioactivity (RT-CES) assay were investigated by Hoechst staining, cell cycle (FACS) and Western blot assays in most sensitive Huh7 cells. Compounds 2, 16, 18, 20, 21, 22 and 27 induced apoptosis by caspase activation, increased apoptotic subG1 populations and caused cell cycle arrests at G1 and/or G2/M phases in liver cancer cells. In addition, 21 showed increase in the expression of tumor supressor gene p53, while 2 displayed condensed nuclei in Hoechst staining assay indicating apoptotic cell death morphologically in Huh7 cells. Thus, aforementioned compounds particularly 2 and 21 established very promising results and could be potential lead molecules which deserve further in vivo and clinical investigations for anticancer drug development especially against hepatocellular carcinoma.