Investigation of GSTP1 promotor region methylation in peripheral bloods of prostate cancer

Abstract

Bu projede, periferal kanda GSTP1 genine ait promotör bölge metilasyon analizinin mümkün olup olamayacağı araştırılmıştır. Bu amaçla, prostat kanserli hastalardan alınan periferal kanlardan DNA izolasyonu yapılmış ve elde edilen izolat kullanılarak GSTP1 genine ait promotor bölge metilasyonu incelenmiştir. İzole edilen DNA'ların bisülfit çevirim işleminden sonra metile ve metile olmayan DNA dizileri için tasarlanan primer çiftleri ve metilasyona özgü polimeraz zincir tepkimesi (MS-HRM) gerçekleştirilmiştir. Sonuç olarak bu metot ile periferik kandan elde edilen DNA izolatı incelendiğinde, lökosit gDNA'sının içerdiği yoğun miktarda metile olmayan DNA varlığı nedeniyle, GSTP1 genine ait promotor bölge metilasyonunun tespit edilemediği gözlenmiştir. Aynı DNA izolatları, yüksek hassasiyeti ve özgünlüğü sayesinde en doğru ve güvenilir araçlardan biri olarak bilinen ddPCR ile incelenmiş ve 65 adet örnekten 2 tanesinde GSTP1 geni promotor bölgesi metile olarak saptanabilmiştir. Bu çalışmada, GSTP1 promotor metilasyonunu saptayabilmek için kullanılan üçüncü metot ise nested PZT ve ardından MS-HRM yöntemlerini içeren kantitatif Nested-MS-HRM metodudur. Bu metodun kullanılmasındaki amaç lökosit gDNA'sına ait metile olmayan GSTP1 fragmentleri ile kıyaslandığında konsantrasyonu çok düşük olan tümörlü hücrelere ait metile GSTP1 fragmentlerinin kopya sayısının arttırılması ve metilasyonu saptamak için gerçekleştirilecek MS-HRM' in hassasiyetinin ve özgünlüğünün arttırılmasıdır

In this project, it was investigated whether it is possible to analyse the promoter region methylation of GSTP1 gene in peripheral blood. For this purpose, DNA was isolated from peripheral blood of prostate cancer patients and the promoter region methylation of GSTP1 gene was examined by using the obtained isolate. After bisulfite modification of the isolated DNAs, Methylation Sensitive High-Resolution Melting (MS-HRM) was performed using primer pairs designed for methylated and unmethylated DNA sequences. As a result, when MS-HRM method applied to the peripheral blood DNA isolates, GSTP1 promoter methylation could not detected due to due to the presence of excessive amount of unmethylated leukocyte gDNA. The same DNA isolates were examined by ddPCR, which is known to be one of the most accurate and reliable tools due to its high sensitivity and specificity and 2 of 65 samples were detected as GSTP1 methylated. In this study, the third method used to detect GSTP1 promoter methylation was Nested MS-PCR method which consists of Nested PCR and MS-HRM. The purpose of this method is to increase the number of copies of methylated GSTP1 fragments released from the tumour cells which has very low concentration compared to unmethylated GSTP1 fragments of leukocyte gDNA and to increase the sensitivity and specificity of the MS-HRM to be performed to detect methylation. With this method, methylation was detected in the promoter region of GSTP1 gene in 9 of 65 samples.As a result of this study, although the sample could not be collected in accordance with ctDNA studies, it was shown that it is possible to detect promoter region methylation using appropriate methods.Bu yöntem ile toplamda 65 örnekten 9 tanesinde GSTP1 geni promotor bölgesinde metilasyon varlığı saptanmıştır. Bu çalışmanın sonucunda ctDNA çalışmalarına uygun olarak örnek toplanamamış olsa da uygun yöntemler kullanılarak promotor bölge metilasyonunun saptanabileceği gösterilmiştir.