Evaluating the interactions between neurofilament promoters and the ETS transcription factor PEA3 by using different cell lines

Abstract

Ets transkripsiyon faktörü ailesinin bir üyesi olan PEA3 proliferasyon, farklılaşma, apoptoz ve transformasyon gibi pek çok hücresel olayda rol oynamaktadır. Ailenin diğer üyelerinden farklı olarak, PEA3 ile yapılan çalışmaların çoğu bu proteinin karsinojenezdeki görevlerine odaklanmaktadır. Nörofilamentler, sinir hücresi iskeletinin kurulmasında yer alırlar ve üç farklı boyuttaki alt ünitelerden (hafif NF-L, orta NF-M ve ağır NF-H) oluşurlar. Bu tezde, NF-L ve NF-M alt unite promoterlarında mPEA3 transkripsiyon faktörünün transaktivitesine göre oluşacak anlatım farklılıkları ile mPEA3'nin varsayılan fosforilasyon bölgeleri üzerinde çalışmalar yapılmıştır. Bunun için, nörofilament promoterları üzerindeki varsayılan mPEA3 bağlanma motiflerinde ve MAPK yolağının fosforile ettiği düşünülen mPEA3 kısımlarında mutasyonlar oluşturulmuştur. Yabani türler ile mutant formlar arasındaki farklılığı ölçmek için yönlendirilmiş mutasyon, lusiferaz assay, kromatin immünopresipitasyon (ChIP) ve Western blot yöntemleri kullanılmıştır. NF-L promoter aktivitesi için ikincil ets bağlanma motifi önemliyken, NF-M promoter aktivitesi için varolan tek ets bağlanma motifinin Pea3 ile ilişkide etkili olduğu görülmüştür. Sonuçlar farklı yöntemlerle desteklenip genişletilmelidir.

PEA3, a member of the widely-known Ets transcription factor family, takes role in many of the cellular processes including proliferation, differentiation, apoptosis and transformation. Apart from other members of the family, the studies on PEA3 are usually focused on its function in carcinogenesis. Neurofilaments are well-known for taking part in constitution of neuronal cytoskeleton and are made up of three subunits that different in size, namely light (NF-L), medium (NF-M) and heavy (NF-H) subunits. In this thesis, the relationship between expression of NF-L and NF-M subunit promoters and transactivity of mPEA3 transcription factor were assessed together with investigating the putative phosphorylation sites for mPEA3. For this, mutations were created at putative binding motifs for mPEA3 on neurofilament promoters and at putative sites for mPEA3 phosphorylation by MAPK. Site directed mutagenesis (SDM), luciferase assay, chromatin immunoprecipitation (ChIP) and Western blot were used for measuring differences in transactivation wild type and mutant promoter or transcription factors on NF-L and NF-M promoters in SH-SY5Y and HEK 293 cell lines. For NF-L promoter activity the secondary ets binding motif was crucial while for NF-M promoter activity the mere ets binding motif was found to be in interaction with Pea3. The results have to be further proved and expanded with other methods.