Identification of mycobacterial species by sequence specific polymerase chain reaction

Abstract

Tüberküloz Türkiye?de ve dünyada en önemli sağlık sorunlarından biri olmaya devam etmektedir. İnsanda en sık enfeksiyona yol açan mikobakteri türü Mycobacterium tuberculosis?tir. Ancak yirmi kadar başka mikobakteri türünün daha insanda çeşitli enfeksiyonlara yol açtığı bilinmektedir.Bugüne dek doğada 170 kadar mikobakteri türünün varlığı saptanmıştır. Bunların bir kısmı zaman zaman hastalardan alınan örneklerden yapılan kültürleri kontamine edebilmektedir. Hastalardan alınan örneklerden yapılan kültürlerde mikobakteri üretildiği zaman bunun mutlaka türünün saptanması gerekir. Çünkü insanda tüberküloza en sıklıkla yol açan M. tuberculosis enfeksiyonunun tedavisinde kullanılan ilaçlar diğer mikobakteri enfeksiyonlarında genelde etkili olmamakta, başka antimikobakteriyel ilaçlar tedavide kullanılmaktadır. Yine kültürleri kontamine eden ancak insanda enfeksiyona yol açmayan mikobakteriler, türlerinin belirlenmesi sayesinde saptanabilmekte ve hastaların gereksiz yere tedavi alması engellenmektedir.Mikobakteriler için klasik tür saptama yöntemi kültürde üreme hızı, pigment oluşturma ve çeşitli biyokimyasal özelliklerine dayanmaktadır. Yavaş üreyen M. tuberculosis gibi mikobakterilerde bu yöntemle tür saptama 2 ay kadar sürmekte ve birçok kez kesin olmayan sonuçlar vermektedir. Bu süre içerisinde hastalara hatalı tedavi verilebilmektedir. Tür saptanmasını hızlandırabilmek, özgüllüğünü arttırabilmek için son yıllarda çeşitli moleküler yöntemler geliştirilmiştir. Bunlardan ticari kit haline gelen en gelişmişleri dahi sadece 16 kadar mikobakteri türünü saptayabilmektedir.Bu projede diziye özgül polimeraz zincirleme tepkimesine dayanan, kültürde üretilmiş mikobakterilerin türlerinin tamamını kolayca ayırt etmesi beklenen bir yöntem geliştirdik. Mikobakterilerin 16S ribozomal RNA, hsp65 ve gyrB gen dizilerine özgülprimerler ile çoğaltma ürünü elde edilip edilmemesine dayalı bu yöntemde, diğer yöntemlerde olduğu gibi tek türe özgül DNA dizileri yerine, türleri gruplara bölen aşamasal (algoritmik) ayırma sistemi kullandık. Böylece bu yeni yaklaşım ile az sayıda diziye özgü primer ile tüm mikobakteri türlerinin kolayca ve diğer yöntemlere kıyasla daha az harcama ile saptanması olanaklı kılan bir yöntem geliştirdik.

Tuberculosis continues to be one of the most important health problems in Turkey and around the world. Mycobacterium tuberculosis is the agent which is responsible for most of the mycobacterial infections in humans. On the other hand approximately 170 species of mycobacteria are identified.Some of these may sometimes contaminate the cultures of the samples obtained from patients. When a type of Mycobacterium is isolated from a patient, its species should definitely be identified. Because, the antimycobacterial drugs used in the treatment of infections caused by M. tuberculosis, which is the most common cause of mycobacterial infections in humans, are not usually effective in the treatment of infection caused by other mycobacteria and different drugs are used for the treatment of these infections. Additionally, mycobacteria that contaminate culture media but which do not cause infection in humans are also identified by species identification and unnecessary treatment of the patients is thus eliminated. Classical identification of mycobacterial species depends on their rate of growth in culture media, their pigment formation and biochemical characteristics. In slow growing species like M. tuberculosis, classical species identification takes about two months and in many cases the results are controversial.In recent years, several molecular methods were developed to speed up species identification and to increase the specificity. However the most developed and commercially available kits can only identify 16 mycobacterial species. In this project we have developed and evaluated a sequence specific polymerase chain reaction which is expected to be capable of differentiating all mycobacterial species easily, from organisms grown in culture.In this method, which depends on obtaining or not an amplification product using sequence specific primers for the genes that encode 16S ribosomal RNA, hsp65 and gyrB, the strategy is not to use primers specific for single species but primers that divide species into groups and identify species in an algorithmic way. With this new approach it is possible to identify all mycobacterial species, using fewer sequence specific primers with lower cost and effort compared to other methods.