Cartilage tissue engineering on three dimensional scaffolds using human tooth germ stem cells

Abstract

Kıkırdak doku mühendisliği stratejileri, hücre içeren biyobozunur biyomalzemelerin tasarlanarak, hastalıklı veya hasar görmüş kıkırdak dokusunun tamir edilmesi veya yenilenmesi için o bölgede kullanılması üzerine odaklanmıştır. İnsan yirmi yaş diş jermlerinden elde edilen diş kök hücreleri (HTGSC) beş - altı yaşa kadar özelleşmediklerinden dolayı önem teşkil eden hücre kaynakları olarak gösterilmişlerdir. Ayrıca, bu hücrelerin kıkırdak hücrelerine dönüşebilir özellikte olduğu da ispatlanmıştır. Matriks malzemesi olarak PCL ve PLLA, biyouyumlulukları ve işlenebilirlikleri sayesinde, doku mühendisliğinde en sık kullanılan malzemelerden iki tanesidir.Kıkırdak oluşumunun, HTGSClerin PCL, PLLA ve PCL:PLLA (50:50) karışımı gibi farklı 3-boyutlu matriksler üzerinde kondrositlere özelleştirilmeleriyle sağlanması, bu çalışmanın temel amacıdır. Bu amaçla, PCL, PLLA ve PCL:PLLA matriksler, tuz yıkama tekniği ile hazırlanmıştır. Önce matriks topografileri taramalı elektron mikroskopisi ile incelenmiştir. Sonra HTGSCler, süngerler üzerinde kıkırdağa özelleştirici besi yeri içerisinde 3 hafta boyunca büyütülmüştür. Matriksler üzerindeki hücre çoğalması MTS analizi ile tayin edilmiştir. Morfoloji ve özelleşmeyi analiz etmek için immün boyaması yapılmıştır. Kıkırdağa özgü genlerin ifade düzeylerini belirlemek için eş zamanlı PCR tekniği kullanılmıştır.İmmünohistokimya analizlerine göre hücreler, matriksler üzerine tutunmuş ve kıkırdağa özgü ECM biriktirmişlerdir. MTS analizi ile gösterildiği üzere, bütün matriksler hücre çoğalmasını desteklemişlerdir. Kıkırdağa özelleşme besi yeri içinde 21 gün bekletildikten sonra kollajen tip II ifadesinin bütün matrikslerde arttığı gözlemlenmiştir. Hücrelerdeki agrekan ifadesi ise PCL ve PLLA matrikslerinde azalırken, PCL:PLLA matriksinde artmıştır. Bu sonuçlar, bütün matrikslerin, özellikle PCL:PLLA'in, HTGSClerin kıkırdak hücrelerine farklılaşmalarını desteklediğini göstermektedir.

Cartilage tissue engineering strategies are mainly focused on repairing or regenerating a diseased or damaged joint cartilage tissue through the design and use of cell-containing biodegradable biomaterials. Dental stem cells obtained from tooth germs of human third molars (wisdom teeth) were shown to be a significant cell source since they do not differentiate until the age of five - six. Besides, these cells were proven to be capable of chondrogenic differentiation. As a scaffold material, PCL and PLLA are two of the most frequently used biomaterials in cartilage tissue engineering applications due to their high biocompatibilities and processabilities.The main objective of this study was to induce cartilage regeneration through differentiation of HTGSCs into chondrocytes on different 3-D scaffolds. For that purpose, PCL, PLLA, and PCL:PLLA (50:50) scaffolds were prepared by salt leaching technique. First, scaffold topographies were studied by scanning electron microscopy. Then, HTGSCs isolated from impacted third molar tooth germs of young adult patients were grown on the scaffolds in the chondrogenic differentiation media for 3 weeks. Cell proliferation on the scaffolds was quantified by MTS assay. Immunostaining was carried out for morphological and differentiation analyses. Real Time PCR was performed to determine the expression levels of cartilage-specific genes.Immunohistochemistry analyses revealed that the cells attached onto the scaffolds and deposited cartilage-specific ECM. As shown by MTS assay, all of the scaffolds supported cell proliferation. After 21 days of incubation in cartilage differentiation media, expression of collagen type II was increased in all cells seeded onto scaffolds. Aggrecan expression by cells was decreased on PCL and PLLA scaffolds but increased on PCL:PLLA. These results suggest that, all of the scaffolds, especially PCL:PLLA, favored chondrogenic differentiation of HTGSCs.