The roles of phosphoinositide-3 kinases/akt phosphorylation in the neuroprotective effects of melatonin on neuronal survival In-vitro and In-vivo

Abstract

Melatonin az ve çok gelişmiş organizmaların tümünde bulunan ve çok bilinen sirkadyen ritim kontrolünü sağlayan önemli bir hormonudur. Melatoninin circadian ritim regülasyonu dışında farklı biyolojik mekanizmalar ile de ilişkisi bulunmaktadır. Bunlar; yaşlılık, antioksidan temizlenmesi ve hücresel canlılık olaylarıdır. Bu projenin arka planına bağlı olarak, bütün bu biyolojik aktiviteler içerisinde ilgi hücresel canlılığa yönlendirilmiştir. PI-3K/Akt sinyal yolağının melatoninin nöroprotektif etkilerindeki rolü, PI-3K/Akt inhibitörü olan Wortmannin in yardımıyla, hem in vitro model olarak primer kortikal hücre kültüründe hem de in vivo model olarak MCAO hayvan deneyleriyle test edilmiştir. Primer kortikal hücre kültürü yeni doğan (1. gün-3.gün) Balb/C farelerinden alınarak yapılmıştır ve devamı olarak hipoksi- OGD deneyi kültürün 7. Gününde başlatılmıştır. Melatonin ve Wortmannin tedavileri hipoksi-OGD ve reperfüzyon aşamalarında eklenmiştir. In vivo model olarak da yetişkin C57BL farelerine 30 dakikalık MCAO serebral iskemi deneyi uygulanmıştır. Burada, Wortmannin MCAO'dan önce ve melatonin 30 dakikalık MCAO sonrasında enjekte edilmiştir. In vitro hücre canlılığı analizi mikroskopta çekilen canlı hücre resimlerinin değerlendirilmesiyle yapılmıştır. In vivo deneyi analizleri olan Nöron canlılığı analizi ve DNA parçalarına ayırma analizi sırasıyla cresyl violet boyaması ve TUNEL boyaması sonucu hesaplanmıştır. Bu çalışmanın sonucunda; in vitro melatonin grubunda hipoksi ve OGD deneyi sonunda aksonal uzantılar korunmuştur ve hücresel canlılık oranı 52, 46 % olarak bulunmuştur. Benzer olarak melatonin in vivo deney sonucunda önemli bir ölçüde nöronal canlılığı 94.06 % oranında arttırmıştır. Bu proje sonucunda melatoninin nöronal hayatta kalma oranını arttırdığı önemli bir ölçüde in vitro ve in vivo olarak ispat edilmiştir. Bundan başka, nöronal hayatta kalma oranındaki artışın Wortmanninin aynı deney grubuna eklenmesi sonucu normal seviyelere geri dönüşü görülmüştür. Bu buluş da PI-3K/Akt yolağının melatoninin nöroprotektif etkileri üzerinde çok önemli bir rolü olduğunu kanıtlamıştır.

Melatonin is a well-known circadian rhythm regulatory molecule found to be conserved from lower to higher organisms. Melatonin possesses several functions mainly in the biological mechanisms of aging, antioxidant scavenging and cellular survival. Depending on the background of this study, specifically, the attention was drawn into the neuro-survival abilities of melatonin. In our previous studies, we have observed that melatonin increases the phosphorylation of Akt. However, the significance of increased Akt phosphorylation was not known. In the present study, the role of Phosphoinositide-3 kinase (PI-3K) /Akt signalling pathway in the neuro-protective effects of melatonin was tested on primary cortical neuron culture, as in vitro model, and mice cerebral ischemia in vivo model through the use of Wortmannin as a PI-3K/Akt pathway inhibitor. Primary cortical neuron culture was arrived from new born (DIV 1-3) Balb/c mice and the hypoxia-OGD experiment was applied on day 7 of culturing. Melatonin and Wortmannin treatments were introduced during hypoxia-OGD and reperfusion. 30 mins of Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) was applied on adult male C57BL mice for the in vivo experiment model. Wortmannin was administered before MCAO and melatonin was injected after 30 mins of MCAO. The cell survival counting analysis was performed from the pictures taken with confocal microscopy (20X, DAPI). Neuronal survival analysis and DNA Fragmentation analyses were found by applying Cresyl violet staining and TUNEL assay on cross sectioned in vivo experimental group mice brains, respectively. The results of this study indicate that specifically in the melatonin group of in vitro experiments the axonal extensions was protected after cortical cells were exposed to the hypoxic and OGD conditions. Similarly, melatonin significantly increased neuronal survival with the percentage of 94.1 % in vivo. In this study, we provide evidence that melatonin increases neuronal survival from hypoxic cell death both in vivo and in vitro. We further reveal that the inhibition of Akt phosphorylation reverses the neuro-protective effect of melatonin.