The potential role of growth hormone signaling in rotenone-induced neurotoxicity in SK-N-AS cells

Abstract

Rotenon, nörotoksik etkilerinden ötürü tarımda sıkça kullanılan bir pestizitdir. Bu pestizitle çalışan kişilerde uzun vaadede nörolojik problemler gelişebilir. Büyüme hormonunun (Growth hormone, GH) nöronal hücreleri koruyucu ve onarıcı rolü olduğu tespit edilmiştir. Bu tezin amacı GH'nun rotenon uygulanan SK-N-AS neuroblastoma hücreleri üzerinde göstereceği koruyucu ve onarıcı etkisini incelemektir. Bu amaç doğrultusunda, birinci basamak GH geni PC3.1 plazmidi lipozom türevli bir ajan ile aktarılmış ve neomisin uygulanarak GH salgılayan SK-N-AS hücreleri üretilmiştir. GH'nin Rotenon tarafından tetiklenen nörotoksik etkisini koruyucu aktivitesini GH aktarilmiş SK-N-AS hücrelerinde görebilmek ve araştirmak için MTT hücre canlılık testi, büyüme testi, yumuşak agar ve koloni oluşturması deneyleri kullanılmıştır. Bu testlerle, rotenonun SK-N-AS hücreleri üzerindeki doza ve zamana bağlı olan ilişkisi de incelenmiştir. GH'nin ve rotenonun biyolojik etkileri ise protein seviyesinde immunoblotting tekniğiyle kaspaz 3, 7, 9 ve Bcl-2 ailesi üzerinde gözlendi. Sonuç olarak, GH salgılanması SK-N-AS hücrelerinin büyümesini ve çoğalmasını sağlamasına ve bazı testlerde rotenona karşı belli bir koruyucu etki oluşturmasına rağmen, rotenonun negatif etkilerine tamamıyla nötralize etmeye ve apoptozdan korumaya yeterli olmadığı gözlenmistir. Ayrıca rotenona ilaveten antioksidatif ajan N-asetilsistein (NAC) kullanıldığında NAC'in sadece GH aktarılmamış SK-N-AS hücrelerinde apoptozu engelleyebildigi tespit edilmiştir. JAK/STAT sinyal yolağı proteinlerin immunoblotla incelenmeside sadece STAT1 proteininde dikkate değer bir artış gözlenmiştir. Buna ilaveten yine immunoblot analizinde SK-N-AS hücrelerinin apoptozda kaspaz 9 üzerinden mitokondriyal içsel apoptoz yolağını tercih ettikleri onaylanmıştır.

Rotenone is a widely used pesticide, leading to neurotoxic effects and may also affect humans. Growth hormone (GH) has been reported to have neuro-protective and/or neuro-repairing effects on neuronal cells. The aim of this thesis is to demonstrate the potential neuro-protective effect of induced GH expression in rotenone treated neuroblastoma SK-N-AS cells. In order to accomplish this purpose, we generated GH expressed SK-N-AS neuroblastoma (NB) cells by using GH gene inserted PC3.1 plasmid by lipofectamine transfection and neomycin selection. The protective role of transfected GH expression on rotenone-induced neurotoxicity in SK-N-AS cells was investigated by cell viability assay, growth assay, soft agar and colony forming assay, the latter for determination of dose- and time-dependent rotenone effects. On protein level, rotenone effects on caspase 3, 7, 9 and Bcl-2 family members were investigated by immunoblotting in SK-N-AS wild type (wt) and SK-N-AS GH transfected cells for the evaluation of biological protective and repairing effect of GH signaling. In cell viability assay, the amounts of vital cells were significantly higher in GH transfected SK-N-AS cells than wt SK-N-AS cells, but GH was not effective to completely protect NB cells from apoptosis. In addition, the antioxidative agent N-acetyl-L-cysteine (NAC) was effective in prevention of rotenone-induced apoptosis only in SK-N-AS wt cells. Immunoblotting of JAK/STAT signaling pathway proteins demonstrated a STAT1 increase in rotenone treated SK-N-AS GH+ transfected cells. The preference of SK-N-AS cells for the caspase-dependent (caspase 9 activation) intrinsic apoptosis pathway and the mitochondrial involvement including ROS generation could be confirmed.