Substrate characterization of putative ancestral xyloglucan endotransglycosylase/hydrolases

Abstract

Bitki hücre duvarı polisakkarit, glikoprotein ve yapısal proteinlerden oluşur. β zincirlerinden oluşan ksiloglukan, dikot hücre duvarında en bol bulunan, aynı zamanda monokot hücre duvarında da az miktarda bulunan selülozik olmayan polisakkarittir. Ksiloglukaz transglükozilaz/hidrolaz enzimi ksiloglukanın temel zincirini katalizler ve ksiloglukaz zincirinde bulunan glikoz bağlarının kırılıp tekrar bağlanmasında görev alır. Ayrıca bazı Ksiloglukaz transglükozilaz/hidrolaz enzimleri hidrolaz aktivitesi gösterir. Böylece, hücre duvarının gevşemesi ve güçlenmesinde büyük etkisi vardır. Ksiloglukaz transglükozilaz/hidrolaz enzimini karakterize etme hücre duvarındaki modifikasyonları daha iyi anlamamıza yardımcı olur. Bugüne kadar hücre duvarı modifikasyonlarını daha iyi anlamamızı sağlayan çok az çalışma yapılmıştır. Bu projede, Gossypium hirsutum GhEG16, Hordeum vulgare HvEG16, Arabidopsis thaliana AtXTH3, ve Triticum aestivum TaXTH9 enzimlerinin ayrıntılı bir şekilde incelemesinin yapılması amaçlanmıştır. Her enzimin heterolog üretimi ve saflaştırılması yapılmıştır. Sonrasında substrat karakterizasyonu ve kinetik çalışmaları yapılmıştır. Çalışmalar sonrasında, GhEG16 ve HvEG16enzimlerinin heterolog ekspresyonları başarıyla gerçekleştirilememiş. Ayrıca TaXTH9 enziminin hint hurması tohumu yerine hidroksietil selüloz donor polisakkaritine daha fazla eğiliminin olduğu ve AtXTH3 enziminin hint hurması tohumu yerine arpa- β-glukan donor polisakkaritine daha fazla eğiliminin olduğu gözlemlenmiştir. XTH enziminin substrat özgüllüğü ve rollerinin aydınlatılması gıda, kozmetik, kağıt üretimi ve biyoethanol üretimi gibi endüstriyel alanların gelişmesine yardımcı olacaktır.

Plant cell walls are composites of various carbohydrates, glycoproteins, and structural proteins. Xyloglucan is a non-cellulosic β-linked polysaccharide which is very abundant in the cell walls of dicots and is in short supply of monocots. Xyloglucan endotransglycosylase/hydrolases (XTHs) catalyze matrix polysaccharide rearrangement, cleaving and ligating glycosidic bonds of xyloglucan chains. A sub-group of the XTH superfamily, the EG16 group, have recently been shown to be strict hydrolases, lacking the transferase ability, but are able to act on a range of different polysaccharides. Therefore, XTHs are involved in processes such as wall loosening and strengthening. Characterization of XTH enzymes can help us to understand about various cell wall modifications. Until today, only a few studies have been done to enlighten these cell wall modifications. In this study, the aim was to examine various member of the XTH superfamily, specifically GhEG16 from Gossypium hirsutum, HvEG16 from Hordeum vulgare, AtXTH3 from Arabidopsis thaliana, and TaXTH9 from Triticum aestivum, in detail. Heterologous expression and purification were attempted for all enzymes. Finally, substrate characterization and kinetic studies were performed. Heterologous expression of active GhEG16 and HvEG16 enzymes could not be achieved, however the two true XTH enzymes were successfully expressed. Interestingly, AtXTH3 was shown to have a higher affinity for barley-β-glucan than tamarind seed xyloglucan as a substrate donor, the first time that such a ratio has been detected. Also of note, TaXTH9 has a higher affinity for hydroxyethyl-cellulose donor substrate rather than tamarind seed xyloglucan. Enlightening the substrate specificities and roles of these XTHs may lead to their development in agricultural and industrial areas such as food, cosmetics, paper and bioethanol production.